全新思路！“单细胞”角度探究“天然化合物”在非肿瘤疾病中的作用机制，江西中医药大学团队2个月发了14+！

学术 2024-11-07 10:02 上海

最近有小伙伴私信小云，有没有单细胞的非肿瘤研究思路，当然有啦，马上安排！

这篇文章是来自江西中医药大学团队，文章为我们呈现一个新的研究思路：天然化合物+单细胞测序，可复现性非常强。一起看看吧~

1.文章利用scRNA-seq技术，对糖尿病肾病诱导的肾脏损伤以及迷迭香酸治疗的影响进行了深入研究。

2.通过结合典型细胞标记和簇特异性表达基因来验证每个细胞簇的身份，提高了细胞类型注释的准确性。

3.文章不仅分析了单个细胞的基因表达，还通过分析了基因调控网络和细胞间交流，揭示了该化合物治疗对肾脏细胞间通信的影响。

小云认为，咱们还可以从中药活性成分的角度入手，结合一些中医药方面的分析，能进一步增加研究的创新性，感兴趣的小伙伴可以滴滴小云哦！课题设计、生信分析、服务器租赁…这里统统都有，小云全方位助力每一个科研梦想!

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题目：单细胞转录组学揭示迷迭香酸通过调节氧化应激和炎症对糖尿病肾病所致肾损伤的改善作用

杂志：Acta Pharmaceutica Sinica B（IF：14.7）

发表时间：2024.4

关注公众号，后台发送“123”可以直接获取原文PDF，文献编号：241107

研究背景

糖尿病肾病（DN）是糖尿病的严重并发症，以肾脏结构和功能改变为特征。天然产物迷迭香酸（RA）已被证明具有治疗作用，包括抗炎症和抗氧化应激，对肾脏损伤或功能障碍。该研究在单细胞水平上表征了肾脏对DN诱导的损伤和RA治疗的细胞反应的异质性。

研究思路

研究结果

DN诱导小鼠肾损伤和RA治疗的单细胞谱

为了评估RA对DN的影响，作者使用质谱技术对冷冻保存的肾组织进行了scRNA-seq和蛋白质组学分析，这些组织分别来自正常小鼠（normal）、DN模型（DKD）和RA处理的DN （DKD_RA）样本(3个队列，6个样本进行scRNA测序；3组9个样本进行蛋白质组学分析)。随后，收集Normal、DKD和DKD_RA样品进行scRNA和蛋白质组学测序及下游分析。此外，在DN小鼠肾组织中观察到组织病理学的变化，如小管上皮的空泡性恶化。

利用经典标记基因，鉴定了13个细胞系。值得注意的是，发现了一种高表达Cdca3、Mki67和Stmn1的细胞类型，该细胞类型在一项已发表的研究中被鉴定为一种新的细胞类型。将这些基因的表达投射到UMAP上进一步表明了细胞谱系特异性。

接下来，与正常组相比，DKD中PT（近端小管）的比例从63.78%增加到76.26%，与糖尿病期间近端小管细胞的增殖一致。对于包括ALH， CD-PC， CD-IC和Podo在内的谱系子集，DKD组的比例下降，而RA治疗可以部分挽救这种下降。这些结果显示DN诱导的细胞分布变化，包括增殖细胞比例增加和某些上皮细胞减少，这些细胞在RA治疗后部分恢复。

对类风湿性关节炎治疗反应的细胞异质性

为了揭示这些细胞变化背后的分子机制，Seurat的FindMarker被用来鉴定每种细胞类型的差异表达基因（DEGs）。分析显示，在RA治疗后，PT表现出最多的DEGs，其次是ALH。此外，大多数DEGs主要在单一细胞类型中发现，强调了对RA治疗反应的细胞异质性。有趣的是，RA处理后ALH在PT中发现最多的拯救基因，而在Neutro、B和Podo（足细胞）细胞中没有发现拯救基因。此外，观察到几个被拯救的基因，如Atox1、Abca1、Nfkb1和Il1b，参与氧化应激和炎症。与炎症相关的功能途径，包括通过NF-κB传递TNF-α信号、氧化磷酸化和凋亡，在RA治疗后被拯救的基因中富集。接下来，发现Podo、DLH和PT对氧化应激反应的模块评分高于其他细胞，而Neutro和Mφ对炎症反应的模块评分高于其他细胞。

RA治疗可减轻DN所致的PT S1细胞损伤

为了探讨PT在DKD组中的潜在机制，作者对PT相关DEGs进行富集分析，发现这些基因主要富集于代谢过程和氧化应激相关通路，如小分子分解代谢过程、尿酸代谢过程、活性氧代谢过程、氧化磷酸化和细胞对缺氧的反应等。作者将PT细胞重新聚为12个簇，根据经典标记分配身份，得到了三个亚型（S1、S2和S3），每个亚型都有特定的表达模式。S1和S3片段以其对应标记的表达为特征，而S2的标记基因（Fxyd2、Mif和Gsta2）也在其他片段中表达，代表了PT的过渡状态。此外，与正常小鼠相比，DKD组S2段的组成增加，这种增加在RA治疗后部分逆转。在S1中观察到相反的趋势。

进一步分析发现，损伤标志物（C3、Myc、Dcdc2a和Sema5a）主要富集于S1和S3，这与两种亚型相比S2的炎症评分较高相符。为了进一步深入研究炎症的细节，作者将炎症评分投影到UMAP上。炎症评分最高的S1损伤评分在DKD组中显著升高，而RA治疗与蛋白质组学结果一致，显著逆转了这一趋势。因此，作者研究了三组S1中参与氧化应激、伤口修复和炎症的基因的表达模式，发现RA治疗减轻了氧化应激基因，以及伤口修复基因。此外，根据转录因子（TF）调节活性的预测，发现促炎TF在DKD组中被激活，而RA治疗降低了它们的活性评分。综上所述，RA治疗可通过调节创面修复、氧化应激和炎症反应改善DN所致PT S1损伤。

RA治疗可改善DN小鼠足细胞损伤

为了研究RA治疗对其他上皮细胞段的影响，作者将这些肾细胞重新聚集成9个具有簇特异性标记基因的亚型，包括DLH、DCT1、DCT2、ALH、CD-PC、A-IC、B- ic、CD-Trans和Podo。在DKD组中，ALH、B-IC和Podo的比例下降，而DCT2、A-IC和CD-PC亚型的比例明显增加。与DKD相比，RA处理略微逆转了这些节段的比例变化。

接下来，作者检测了损伤标记基因（Vcam1、C3、Cp、Lcn2和Clu）在所有节段中的表达分布，表明损伤基因存在异质性表达。为了进一步评估这些节段的DN诱导损伤，作者计算了这些节段的炎症和损伤模块评分。与损伤标记基因的表达分布一致，结果显示Podo在这些亚型中具有最高的炎症和损伤评分。因此，为了评价RA处理对Podo的影响，作者首先对Podo的DEGs进行了富集分析。研究结果发现，在DKD与正常对照中，一些炎症相关通路上调。相反，这些通路在DKD-RA和DKD中下调。此外， RA治疗降低了Podo亚型中参与细胞趋化性、氧化应激和损伤的基因的表达。

总的来说，DKD组这些上皮段对损伤的异质性反应，RA治疗能够通过调节细胞趋化性和氧化应激来改善Podo损伤。

RA治疗可减轻炎症，减少S100a4巨噬细胞的募集

巨噬细胞表现出显著的可塑性，使它们能够根据来自局部微环境的信号调整功能，并在炎症信号或抗原加工的反应中招募额外的巨噬细胞。作者从数据集中重新聚集巨噬细胞，并鉴定出四种亚型（Gpx3+Mφ, Cd86+Mφ， S100a4+Mφ和Cd163+Mφ），每种亚型都具有独特的表达模式。

接下来，作者对每个亚型的两种比较（DKD与正常、DKD_RA与DKD）之间的DEGs进行了富集分析。Cd86+Mφ和S100a4+Mφ中的DEGs主要富集于DKD的炎症过程中，而RA治疗降低了这些炎症相关反应。此外，RA治疗后Cd86+Mφ和S100a4+Mφ中与活性氧、缺氧和炎症相关的信号或基因显著下调，表明RA治疗可以改善炎症和ROS。炎症相关TF的活性评分也通过RA治疗得到改善。Western blot分析进一步证实了RA治疗的抗炎作用（图5G）。

总之，研究结果表明，RA治疗可以减少S100a4+Mφ的募集，逆转DKD中促炎和ROS相关基因的高表达水平，减轻Cd86+Mφ和S100a4+Mφ亚型的炎症。

类风湿关节炎治疗可改善DN小鼠的免疫功能障碍

淋巴细胞T、B细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）在先天免疫和适应性免疫中发挥重要作用。作者从数据集中重新聚集了免疫细胞，并基于经典标记和集群特异性基因获得8个亚型。其中，T_C1、T_C2和T_C3表现出CD8特征，表达Cd8b1。T_C1和T_C2的百分比在DKD组中增加，而在DKD_RA组中减少。相反，T_C3表现出相反的趋势。此外，观察到DKD小鼠B_C1和NK细胞比例的明显变化，随后通过RA治疗逆转，而其余亚型表现出轻微变化。此外，在所有亚型的NK细胞中显示出最高的细胞毒性和炎症模块评分。与DKD_RA组相比，RA治疗有效改善了DKD中NK细胞的细胞毒性和炎症反应，并降低了NK细胞中炎症相关基因Cd48、Cd69、Cxcr6、Ccl5等的表达。接下来，作者观察到NK细胞中上调的基因在细胞因子介导的信号通路中富集，并在RA治疗后积极调节免疫反应。相反，下调基因在凋亡过程、T细胞增殖负调控和细胞粘附调控中富集。

RA介导DN小鼠肾脏细胞间串扰

为了研究RA治疗对小鼠肾脏中DN细胞间相互作用的影响，作者使用潜在配体受体（LR）对评估了不同细胞类型和亚型之间的细胞通讯。发现在正常、DKD和DKD_RA组的细胞类型中广泛存在串扰。为了详细探讨关键细胞类型的细胞通讯，作者检测了来自M1样巨噬细胞Cd86+Mφ， S100a4+Mφ， NK， PT S1和Podo的信号。与正常队列相比，DKD组S100a4+Mφ与CP-PC、Neutro、NK、T_C2和TC_3之间的信号增加。此外，DN微环境增加了NK细胞与炎症细胞亚型Neutro、Cd86+Mφ和S100a4+Mφ之间的细胞通讯，表明DN引起的细胞间串扰功能障碍主要涉及M1样巨噬细胞、NK、Neutro和T细胞亚型。此外，作者鉴定了特异性的配体受体（LR）对，并确定了10对显著的LR对。

文章小结

该研究使用单细胞测序来分析DKD模型和RA治疗的转录组变化。研究结果表明，RA可以改善肾小管上皮损伤，特别是对PT S1和肾小球上皮细胞（足细胞）的损伤，并减轻DN诱导的氧化应激和炎症。此外，RA减少了DN期间与促炎信号相关的S100a4巨噬细胞的募集，并重塑了免疫微环境。总的来说，该研究强调了RA在治疗DN中的重要性，并提出了可能用于DN诊断的新型生物标志物。

目前，单细胞测序在肿瘤研究中应该比较多，在非肿瘤中的这种探究药物作用机制的研究创新性很足，小伙伴们可以考虑用其他天然化合物或者中药活性成分结合单细胞测序进行研究。小云可以在方案设计和生信分析方面为您提供全方位的服务。想自学单细胞的宝子可以看一下我们的课程哦：

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