生信分析结果用qPCR或WB验证不出来，我该怎么办？

学术 2024-11-10 10:00 上海

前段时间，小云为大家分享了遇到审稿人要求补充验证实验的情况该如何处理：纯生信修回，审稿人要求补充验证实验，我该怎么办？（点击查看）文章发出来以后，就有不少小伙伴私信小云，实验补是补过了，但是结果不理想，要么验证出来差异性不显著，要么表达结果相反，相信这种情况，进行过生信结果验证的宝子肯定遇到过。那么，遇到这种情况该怎么办呢？

首先咱们分析一下为什么会出现这种验证失败的情况呢？

生信是一种高通量RNA-seq，相当于一个未经过验证的批量实验，相对qPCR或者Western Blot一次只能检测一些基因或者蛋白的表达量而言，生信的准确度确实不如qPCR或者WB的。这是生信本身高通量的性质决定的，无法避免。如果抛开这个问题，哪些可能的原因会导致验证结果不一致呢？

1. 样本不一致

实验中最常检测的样本主要细胞、组织和体液。而且，血液样本又可以分为血浆、血清、全血等，组织又可分为新鲜组织、石蜡组织等。选择不同的样本很可能会导致验证失败。

甚至有时选择的样本类型是一致的，但是由于疾病的异质性比较高，样本数量差距比较大（比如高通量测序时只选择几个样本而验证时样本量上百个）也会导致验证失败。

通常情况下，细胞的均一性最好，组织次之，血液最差。

2. 物种不一致

这种情况也很好理解，因为分子在物种间的保守性是有差异的，所以在不同物种间（比如人和小鼠）进行验证时出现验证不出结果的情况。

3. 分子不一致

这种情况可能有的小伙伴不是很清楚。一个基因可能会存在多条转录本，当验证的基因有多条转录本时，在设计引物验证时要注意，检测的是后基因还是某条转录本。

4. 平台不一致

RNA-seq几乎覆盖基因的外显子区域，获得的基因表达量实际上综合了该基因所有外显子区域的表达水平，而qPCR是局部区域设计引物并扩增，并不会考虑到基因全长。ps：目前像孟德尔随机、NHANES、CHARLS、GBD数据库等方向的文章仍然是不需要验证实验的，不想遇到补实验难题的宝子可以考虑这些方向哦，小云可以帮你0实验发文~

验证结果不一致的可能原因不仅仅是以上几点，那么我们该如何挑选基因能避免出现验证失败的情况呢？

1. 选择差异倍数比较大的基因验证

2. 选择满足多重筛选指标的基因

比如表达水平、生存分析、机器学习、WGCNA等均能满足筛选指标的基因进行验证。

3. 多验证几个基因从中挑选符合预期的基因

最后，如果你实在不知道该如何挑选基因也可以联系小云，小云可以在帮你完成分析的同时为你筛选好验证基因。如果你有申请课题的需求，需要设计更复杂的验证实验，小云也能帮你一站式解决，你有好眼光，我有好品质！

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