“单基因研究”费钱？那是你还不懂生信套路！天津医大团队这波“单基因+单细胞”的操作绝了，省钱又省事！拓展一下就是一篇国自然！

学术 2024-11-09 19:00 上海

是不是有小伙伴觉得做单细胞测序研究发文的话，要花费很大成本，小云一看就知道宝子是位科研新人呢。其实通过公共数据分析再加上一点点小实验也可以轻松实现。接下来带着你的好奇心跟着小云往下看喔，看看用低成本发表高分文章是怎样操作的。本篇文章采用了单细胞测序数据分析和实验成功鉴定了癌症三阴性肿瘤转移相关肿瘤亚群中过表达的NENF基因，并对其潜在的靶向治疗药物进行了预测。

这篇文章达到了5分+，接下来小云带小伙伴们一起详细看一下吧~

1.本研究采用当下热门的单细胞测序分析的研究方法，通过对细胞类型进行聚类和进化轨迹分析，揭示了三阴性肿瘤细胞转移的重要特征。并在癌症三阴性肿瘤（TNBC）转移相关肿瘤亚群中成功鉴定出NENF基因；

2.通过临床样本对数据分析结果进行了实验验证，证明了数据分析的准确性，与数据分析完美呼应；

3.本文的研究结果表明，TNBC组织中NENF的表达显著上调。表明NENF的高表达与TNBC转移和患者预后不良相关。此外，还对靶向NENF的潜在药物进行了预测和筛选。ps：如果你最近也在研究单细胞测序分析，那可以试试本文的研究思路喔，不用太多实验就能轻松上5+，非常适合需要发文的科研新人！如果你担心单细胞数据可能用自己的电脑跑不起来，小云这里也提供【服务器租赁】服务哈，新朋友还可以免费试用，咨询还有惊喜哦~

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题目：通过单细胞转录组学鉴定三阴性乳腺癌组织中NENF过表达的肿瘤转移相关亚群

杂志：Cancer Cell Int.

影响因子：IF=5.3

发表时间：2024年9月

研究背景

乳腺癌是最常见的癌症之一，也是女性癌症相关死亡的第二大原因。三阴性乳腺癌（TNBC）被定义为一种雌激素（ER）、孕激素（PR）和人表皮生长因子受体-2（HER-2）阴性表达的乳腺癌。与其他类型的乳腺癌相比，TNBC具有更具侵入性的生物学行为和不良预后。此外，TNBC具有发生早期转移的特征，因此，对于TNBC的转移和发展机制的进一步研究显得非常重要。

神经元衍生神经营养因子（NENF）被证明在几种人类癌症中过表达并诱导肿瘤发生。然而，NENF在TNBC中的作用机制仍不清楚。本研究旨在通过单细胞测序（scRNA-seq）研究原发性和转移性TNBC之间的肿瘤微环境异质性，揭示TNBC转移的潜在机制，并为TNBC提供候选治疗靶点。

数据来源

数据集/队列	数据库	数据类型	详细信息
GSE199515	GEO	scRNA-seq数据	3个TNBC乳腺癌原发样本
GSE143423	GEO	scRNA-seq数据	1个TNBC乳腺癌转移样本
METABRIC-TNBC	METABRIC	RNA-seq数据	319个TNBC样本
TCGA-BRCA	TCGA	RNA-seq数据	113个正常样本和116个TNBC样本

研究思路

本文整体思路如（图1）所示，首先使用Seurat对单细胞测序数据进行质控，通过PCA将scRNA-seq数据集中的所有细胞聚类为不同的细胞簇，并对其进行注释。使用“inferCNV”R进行拷贝数变异（CNV）分析并识别恶性乳腺上皮细胞，使用“Monocle”对恶性乳腺细胞进行分化轨迹分析，获得其转移的重要特征。然后对TNBC细胞中基因共表达模块进行鉴定，分析神经元衍生神经营养因子（NENF）的表达情况。最后通过临床样本对TNBC中分析神经元衍生神经营养因子（NENF）的基因表达水平进行验证。通过在线数据库（https://clue.io/）筛选靶向NENF基因高表达的潜在治疗药物。

图1研究技术路线示意图

主要结果

1.细胞聚类和注释

使用Seurat对数据进行质控后共衍生出11811个细胞，其中包括来自原发性TNBC样本（TNBC1、TNBC2、TNBC3）的8566个细胞和来自脑转移TNBC样本的3245个细胞（TNBC4）。通过PCA将scRNA-seq数据集中的所有细胞聚类成24个不同的细胞簇。使用基于图的降维对高质量细胞进行可视化。如图（2A）所示，不同的细胞簇在空间上差异明显。然后，对所有细胞进行注释并区分了八种不同的细胞类型，包括B/浆细胞、内皮细胞、成纤维细胞、管腔细胞、髓系细胞、肌上皮细胞、T/NK细胞和未知细胞（图2B）。所使用的细胞标记来自细胞标记数据库（图2C）。其中有13个细胞簇（0、2、3、4、5、6、7、9、12、15、16、21和22）被鉴定为管腔细胞。分析描述了上述八种细胞类型在TNBC样本中的比例（图2D），以供进一步探索。

图2不同细胞类型鉴定

2.细胞CNV和再聚类分析

首先使用髓系细胞的CNVs作为参考来推断管腔细胞的CNV。如图（3A-C）所示，TNBC1、TNBC2和TNBC3样本的管腔细胞中CNVs显著扩增或缺失。然后，通过CNV相关性和CNV评分准确分离恶性管腔细胞。如图（3D）所示，由inferCNV定义的恶性细胞在基因表达上表现出高度的异质性，这与对照髓系细胞和正常管腔细胞有显著区别。来源于转移性样本的TNBC4中的管腔细胞被认为是恶性肿瘤细胞。此外，去除了53个正常管腔细胞，共鉴定出7629个已确定的恶性细胞。所有恶性管腔细胞都进行了进一步的降维和聚类，共识别出9个不同的恶性细胞簇（图3E）。

图3细胞CNV和聚类分析

3.TNBC肿瘤细胞不同簇的细胞轨迹和特征

转移趋势是TNBC的一个特征，肿瘤转移过程中的基因表达模式表现出时间异质性。探索TNBC从原代细胞到转移细胞的进化轨迹将有助于更好地理解其潜在的生物学过程。对恶性细胞进行的轨迹分析揭示了细胞轨迹中的三种状态和三个分支（图4A-B），状态3的恶性细胞出现在轨迹的开始（图4C），包括簇2、3和5的细胞簇进化为簇0、1、4、6、7和8。为了进一步研究恶性细胞的异质性，使用Hallmark基因集对每个簇进行评分。伴随着进化轨迹，MARCKSL1、RBP7和STMN1的表达逐渐增加，IFI6和RPL11表现为连续表达。相反，EGFR的关键负调控因子ERRFI1的表达在治疗期间显著降低（图4D）。典型的肿瘤恶性表型相关信号通路，如EMT、E2F靶点、NOTCH信号、PI3K/AKT/mTOR信号，在簇0、4和7中显著富集（图4E）。分析结果表明，上述三个簇可能表现出更强的恶性程度。此外，为了识别TNBC预后不良的集群，使用CIBERSOFTX推断METABRIC数据集中不同集群中TNBC患者的丰度，并结合累积总生存期（OS）信息对不同集群进行生存分析。有趣的是，结果显示，簇0和4与TNBC患者的预后不良显著相关（图4F-G），简而言之，簇0和4显示了不同的肿瘤恶性特征，与TNBC患者的预后不良显著相关。这些发现揭示了TNBC不同簇之间的高度异质性，以及从原代TNBC细胞到转移性TNBC细胞的动态进化过程。

图4细胞轨迹特征分析

4.TNBC细胞间基因共表达模块的鉴定

由于簇0和4与TNBC的预后不良密切相关，因此有必要探索在这两个亚组中发挥重要作用的共表达基因网络。集群0和4的无标度网络是为了获得最佳连通性而构建的，软阈值设置为14（图5A-B）。最终，识别出了七个模块，它们具有代表性的前10个基因（见图5C&E）。模块6和7存在一定程度的相关性，而其他模块构成了另一个相关组（图5D）。另一方面，模块6的富集分数比模块7更集中在第0和第4组，在其他组中几乎没有富集（图3E和5E）。模块6的协调模块特征基因（hME）在簇0和4中显著增加（图5F）。总之，这些发现表明模块6的基因是簇0和簇4的共表达网络，可以促进TNBC转移。

图5共表达基因模块鉴定

5.NENF基因鉴定和预后分析

为了探索驱动肿瘤转移的关键基因，对转移性和原发性肿瘤细胞之间的表达谱进行了差异分析，并鉴定出转移性肿瘤细胞中上调的44个基因，取这个基因集和模块6基因集的交集。总共有16个基因被鉴定为候选基因，包括APOE、ATP6VOE2、C1QBP、CITED4、EFEMP1、FABP7、IGFBP2、KRT10、MIA、NENF、PCSK1N、SERP1、SMS、SPP1、UQCRFS1和ZG16B（图6A）。为了研究16个候选基因的转录水平，在TCGA-TNBC数据集中检测了这些候选基因的拷贝数变异。在TCGA-TNBC样本中，NENF是扩增最显著的候选基因（88/114，77.2%）（图6B）。与图2E一致，NENF主要在簇0、4和7中表达（图6C）。NENF在转移性TNBC中在单细胞和组织水平上均高度表达（补充图S2A-B）。正如METABRIC数据集所预测的那样，较高的NENF表达水平与TNBC的预后较差有关，包括OS（图6D）和无复发生存期（RFS）（图6E）。此外，NENF在TNBC组织中的表达较高，并与晚期有关（图6F-G）。RT-qPCR用于检测30例TNBC组织和配对的相邻正常组织中的NENFmRNA水平，分析结果显示，TNBC标本中NENF的表达显著增加（图6H）。此外，收集20例TNBC组织和配对的相邻正常组织，通过IHC染色检测NENF的表达。与正常组织相比，TNBC组织中NENF的表达显著上调（图6I）。此外，IHC的标准染色评分如图6J所示。综上所述，这些发现表明，NENF的高表达与TNBC转移和患者预后不良有关，并且在肿瘤组织中上调。

图6转移相关基因鉴定和预后分析

6.临床样本实验验证

为探讨NENF在乳腺癌TNBC发生发展中的作用，采用RT-qPCR和western blot分析了乳腺癌症细胞系（MCF-7、T47D、SUM159、CAL-51和MDA-MB-231）中NENF的mRNA和蛋白水平。结果显示，激素受体阳性（HR+）和三阴性乳腺癌症细胞系的NENF表达存在显著差异。显然，与HR+乳腺癌症亚型（MCF-7和T47D）相比，三阴性乳腺癌症亚型（SUM159、CAL-51和MDA-MB-231）中NENF的表达显著更高（图7A-B）。然后，通过使用三种靶向NENF的特异性siRNA来检测NENF缺乏对癌症细胞侵袭和迁移的影响，发现其中两种siRNA可以有效降低CAL-51和MDA-MB-231细胞中NENF的mRNA和蛋白表达（图7C-D）。通过基质胶包被的经孔检测，发现NENF的耗竭导致细胞侵袭率大幅降低（图7E）。同时，NENF的耗竭可以减少Matrigel无涂层透孔（图7F）和细胞伤口愈合试验（图7G）中的细胞迁移。为了研究NENF在癌症EMT中的表达，采用蛋白质印迹法检测上皮和间充质标志物的表达。与对照细胞相比，在NENF耗竭的CAL-51和MDA-MB-231细胞中，E-钙粘蛋白（上皮标记物）的表达显著升高，而N-钙粘蛋白和波形蛋白（间充质标记物）表达降低，表明NENF与EMT呈正相关（图7H）。简而言之，这些结果表明，NENF的耗竭通过调节TNBC中的EMT来减少细胞侵袭和迁移。

图7 qPCR和western实验验证

7.治疗药物筛选

本研究中，对METABRIC数据集的基因矩阵进行了归一化，以预测TIDE数据库中免疫检查点的免疫反应，如图（8A-B）所示，低TIDE评分表明对免疫检查点（ICI）治疗反应强烈，而NENF高表达的患者对ICI治疗反应较弱。这些结果表明，NENF可能是ICI治疗的一个有前景的预测因子。此外，通过在线数据库筛选了针对NENF高表达的潜在治疗药物。高NENF组42种化合物靶向的46种分子途径如（图8C）所示。

图8 治疗药物预测

文章小结

这篇文章真算得上是紧跟当下生信分析热点单细胞测序分析，思路简明清晰，既利用了公共数据库数据，同时又结合实验利用临床样本做了实验验证。并用相应在线数据库对疾病治疗的潜在药物进行了筛选。用生信数据分析+实验的方法轻松完成了一篇5分+的分析文章。可谓是花小力气办大事。

怎么样，看到这里你是不是觉得发表文章好像也没有那么艰难呢？自己是不是也有了新的想法和思路呢？是不是有点蠢蠢欲动了呢。担心不知如何下手的小伙伴们，快来滴滴小云吧，小云为你提供专业科研服务喔！

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