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细胞的各类花式死亡大家了解了吗？还停留在铁死亡，铜死亡研究阶段？可是这已经烂大街了，文章已经发的毫无新意了，那如何创新在众多稿件中脱颖而出，让审稿人一眼肯定你的文章呢？“巨泡式死亡”不妨了解下？现在做的人还不多，发文数量也较少！快跟着小云学起来吧！
巨泡式死亡（Methuosis）是一种非凋亡性细胞死亡形式，其特征是大量来源于巨胞吞噬体的空泡堆积，最终导致细胞代谢活动减少、细胞膜破裂、细胞死亡。目前，Methuosis已在各种癌细胞系中观察到，并被提议作为癌症治疗的潜在靶点。还不看看你的课题能否用起来？
厦门大学医学院是早早用起来了，还一鼓作气发到了14.3分的Advanced Sciences上，而且作者刚硕士毕业一年，真的牛掰！还不看看人家是怎么研究的？文章用新型细胞死亡联合焦亡+凋亡+溶酶体，多热点齐发，干湿结合，设计思路非常值得学习，速速往下看！PS：思维如灵动的火花四溅，却苦于不知如何有序开展？那就来戳戳小云吧！小云助你理清思路，顺利发文！
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题目：巨泡式死亡诱导剂SGI-1027与依维莫司协同通过触发溶酶体膜通透性促进肾癌细胞凋亡和焦亡 肾细胞癌（RCC）是一种常见的泌尿系统肿瘤，其发病率呈上升趋势。尽管早期检测和手术技术在进步，但转移性RCC和术后复发仍然是临床治疗的挑战。mTOR抑制剂依维莫司已被批准用于晚期转移性RCC的治疗，但药物抗性的发展限制了其临床应用。本研究旨在解决依维莫司抗性问题，并为晚期RCC的治疗提供新的见解。1.SGI-1027通过巨胞饮途径诱导肾癌细胞产生空泡CCK-8细胞活力测试、光学显微镜观察、活细胞染色、共聚焦显微镜成像及电子显微镜观察发现，SGI-1027在肾癌细胞株中显示出剂量依赖性的细胞毒性，并且对HK-2细胞的毒性较低，SGI-1027处理的肾癌细胞中观察到大量细胞质空泡的形成，这些空泡倾向于融合和扩张，不与溶酶体、线粒体或内质网共定位，此外，发现SGI-1027诱导的空泡可能源自巨胞饮作用，这是一种液体相内吞过程，涉及形成具有晚期内体特征的大空泡。（A-D）通过非线性回归计算SGI-1027在786-O、A-498、Caki-1和HK-2细胞中的半数最大抑制浓度(IC50)；（E）HK-2、786-O、A-498和Caki-1细胞用1×10−6M或2×10−6M SGI-1027处理24小时，并在显微镜下捕获活细胞图像； （G）786-O和A-498细胞用1.5×10−6M SGI-1027处理24小时，然后与Lyso-Tracker、Mito-Tracker和ER-Tracker孵育30分钟，Hoechst用于细胞核的特异性染色；（H）用1.5×10−6M SGI-1027处理24小时的786-O和A-498细胞中Rab7、LAMP1和LAMP2的免疫荧光染色。2.在肾癌细胞中，SGI-1027诱导的细胞毒性涉及巨泡式死亡通过TEM观察到SGI-1027处理的细胞中出现大量单膜包裹的空泡，而细胞核膜和染色质保持完整，这是methuosis的特征。SGI-1027在诱导空泡化的浓度范围内，凋亡抑制剂Z-VAD-FMK不能阻止SGI-1027诱导的细胞毒性，表明SGI-1027诱导的细胞死亡不依赖于凋亡途径。SGI-1027处理导致LC3B-II的积累，但自噬抑制剂3-MA并不能阻止SGI-1027的细胞毒性，排除了自噬作为主要的细胞死亡途径。坏死抑制剂necroptostain-1也不能防止SGI-1027的细胞毒性，排除了坏死作为主要的细胞死亡途径。这些结果表明巨泡式死亡参与了SGI-1027引起的细胞死亡。（A）786-O细胞用1.5×10−6M SGI-1027处理24小时，然后在制备细胞切片后在透射电子显微镜下观察，绿色和紫色箭头分别表示内质网和线粒体；（B）活细胞图像显示SGI-1027诱导的空泡形成独立于细胞凋亡、自噬或坏死；（C）典型的蛋白质印迹显示PARP和裂解的PARP (Cl-PARP)的表达。786-O和A-498细胞用DMSO（对照）、指定浓度的SGI-1027或10×10−6M顺式二氨基二氯铂（CDDP，阳性对照）处理48小时，通过Western blot检测PARP和裂解的PARP（Cl-PARP），并使用β-肌动蛋白作为内参；（D）为了验证SGI-1027与细胞凋亡之间的关系，用50×10−6M Z-VAD-FMK预处理786-O细胞2小时，然后用2×10−6M SGI-1027或10×10−6M CDDP处理48小时。为了验证SGI-1027与自噬或坏死之间的关系，用2×10−6M SGI-1027、1×10−3M 3-MA、50×10−6M necrostatin-1或50×10−6M necrostatin-1处理786-O细胞，采用CCK-8法检测细胞活力；（E-F）786-O细胞用2×10−6M SGI-1027处理指定时间或用SGI-1027以指定浓度处理24小时，Western blot检测LC3B，GAPDH作为内参。3.SGI-1027与依维莫司协同抑制肾癌细胞增殖细胞成像发现，SGI-1027和依维莫司联合处理能够促进肾癌细胞中空泡的形成，与单独使用SGI-1027相比，联合处理组的空泡数量更多、体积更大。通过药物相互作用评估模型发现，SGI-1027和依维莫司的联合使用在肾癌细胞中表现出显著的协同效应。表现为显著抑制了肾癌细胞的增殖，减少了EdU阳性细胞的数量，导致肾癌细胞在G0/G1期的阻滞。（A）依维莫司促进SGI-1027诱导的肾癌细胞空泡形成。786-O和A-498细胞用DMSO（对照）、5×10−6M依维莫司、1.5×10−6M SGI-1027及其组合处理12小时；（B）协同评分模型证明了SGI-1027和依维莫司的协同作用。用不同浓度的SGI-1027和依维莫司或其组合处理786-O和A-498细胞24小时；随后，根据细胞活力，通过Synergyfinder软件构建协同评分模型；（C）CCK-8测定用于检测用DMSO（对照）、5×10−6M依维莫司、1.5×10−6M SGI-1027及其组合处理指定时间的786-O和A-498细胞的细胞增殖；（D）EdU测定法用于标记处于DNA合成状态的细胞。在EdU染色前，用DMSO（对照）、5×10−6M依维莫司、1.5×10−6M SGI-1027及其组合处理786-O和A-498细胞24小时；（E）SGI-1027和依维莫司对肾癌细胞细胞周期的协同作用。在碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术之前，用DMSO（对照）、5×10−6M依维莫司、1.5×10−6M SGI-1027及其组合处理786-O和A-498细胞24小时分析。4.SGI-1027联合依维莫司诱导细胞凋亡和GSDME依赖性焦亡TEM显示，联合治疗导致肾癌细胞出现凋亡和焦亡的特征性变化，如细胞肿胀、泡状结构和染色质凝聚，以及细胞膜的破裂。LDH释放实验显示，联合治疗在早期就显著增加了LDH的释放，表明细胞膜在细胞死亡过程中发生了损伤，这是焦亡的一个关键特征。Western blot分析发现，联合治疗诱导了PARP、GSDME和Caspase 3等蛋白的剪切，这是细胞凋亡和焦亡的分子标志。（A）用DMSO（对照）、5×10−6M依维莫司、1.5×10−6M SGI-1027及其组合处理24小时的786-O细胞的透射电子显微镜成像；（B）用DMSO（对照）、5×10−6M依维莫司、1.5×10−6M SGI-1027及其组合处理的786-O和A-498细胞的膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)染色；（C）LDH释放测定，检测用DMSO（对照）、5×10−6M依维莫司、1.5×10−6M SGI-1027及其组合处理指定时间的肾癌细胞的LDH释放；（D）A-498细胞用DMSO（对照）、5×10−6M依维莫司、1.5×10−6M SGI-1027及其组合处理24小时，通过Western blot检测PARP、裂解的PARP(Cl-PARP)、GSDME、GSDMD，并使用GAPDH作为内参；（E）A-498细胞用5×10−6M依维莫司和2×10−6M SGI-1027组合处理指定时间，通过Western blot检测PARP、裂解的PARP、GSDME、pro-Caspase 3、裂解的Caspase 3（Cl-Caspase 3），GAPDH用作对照。5.RNA测序分析揭示了协同效应与溶酶体之间的关联RNA-seq在依维莫司组中鉴定出429个上调和104个下调的DEGs，在SGI-1027组中鉴定出714个上调和142个下调的DEGs，在联合组中鉴定出926个上调和341个下调的DEGs。利用Venn图鉴定了联合组特有的329个上调和212个下调的DEGs。基因富集分析有力地证明了SGI-1027诱导细胞巨泡式死亡的能力，并表明了溶酶体在SGI-1027和依维莫司协同作用中的潜在作用。（A）依维莫司组、SGI-1027组以及SGI-1027联合依维莫司组的火山图；（B）依维莫司组、SGI-1027组和SGI-1027联合依维莫司组上调或下调的DEGs的维恩图；（C-D）组合组特有的上调DEGs（C）和下调DEGs（D)的GO和KEGG富集分析；（E）对照组(DMSO)、依维莫司、SGI-1027和联合治疗组中焦亡相关基因表达的热图；（F）组合组中与细胞自噬和溶酶体相关的基因集的GSEA富集分析。该研究首次发现并证明了SGI-1027这种DNA甲基转移酶1（DNMT1）抑制剂能够诱导肾癌细胞的细胞空泡化和巨泡式死亡。通过体内外实验验证了SGI-1027和依维莫司联合治疗的有效性，为未来的临床应用提供了科学依据。大家看完是不是已经有了新idea？你的硕博课题想好了么？明年的国自然申请启动了吗？很多单位要求11月中旬完成初稿，大家真的要抓紧时间啦！有需要记得联系小云哦~
