中医药又现创新！天然药靶筛选只知道用网药？浙大徐腾飞团队整合“虚拟筛选+化学蛋白组学+代谢组学”，2个月登上1区药学神刊！

学术 2024-11-04 10:01 上海

说到天然药靶筛选，小伙伴们是不是首先想到的方法就是网药？反正小云确实是首先想到了网药。今天给大家分享一种新的筛选思路，技不压身，小伙伴们可以了解一下哦~

这篇文章是来自浙江大学药学院徐腾飞团队，该研究文章提出了一种名为“Natural Product Virtual screening-Interaction-Phenotype (NP-VIP)”的用于自然产物的生物活性成分和靶点识别的新策略。该策略整合了虚拟筛选、化学蛋白质组学和代谢组学，仅提高了研究的深度，还减少了单一方法可能产生的假阳性和假阴性结果。现如今，中医药研究如此火热，这种新的靶点筛选方式对于理解和利用传统中药中的复杂化学成分具有重要意义，也能为文章的创新性增色不少。这么赞的文章，大家可以点个收藏，细细品味，小云这里可以提供全方位的生信分析服务，面面俱到，只等你来~

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题目：天然产物虚拟-相互作用-表型目标表征：一种用丹参提取物证明的新方法

发表时间：2024.9

关注公众号，后台发送“123”可以直接获取原文PDF，文献编号：241104

研究背景

天然产物（NPs）历来是药物发现的基本来源。然而，NPs的复杂性在确定生物活性成分和相应靶点方面提出了实质性的挑战。在本研究中，一种创新的天然产物虚拟筛选-相互作用-表型（NP-VIP）策略整合了虚拟筛选，化学蛋白质组学和代谢组学，以鉴定和验证NPs的生物活性靶点。该方法减少了假阳性结果，提高了目标识别的效率。丹参（SM），一种公认的治疗缺血性中风（IS）的草药，被用来说明工作流程。

研究思路

研究结果

丹参提取物（SME）化学成分

为了全面鉴定中药材的化学成分，本研究采用正交液相分离法。成分分析显示，极性较低的化合物比极性较高的化合物更丰富，可能是由于使用了75%的乙醇提取。采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）对各组分进行鉴定。通过文献回顾和串联质谱分析进一步分析了SME的化学特征。为了证明鉴定的化合物之间的片段相似性，采用了GNPS分子网络算法，并使用Cytoscape软件将结果可视化，在SME中显示了10个主要簇。

SME抗缺血性脑卒中的体内外疗效验证

为了评估SME对IS的疗效，本研究采用了体外和体内模型。体外实验采用PC12细胞OGD/R（氧糖剥夺/恢复）模型，体内实验采用大鼠永久性大脑中动脉闭塞（pMCAO）模型，采用多指标评价SME对IS的预防和治疗作用。与对照组相比，OGD/R组细胞存活率显著降低，而SME具有剂量依赖性的保护作用。采用Calcein-AM和PI双染色技术区分活细胞和死细胞，观察到OGD模型组细胞死亡率为55%。然而，用6 μg/mL SME处理后，细胞死亡率显著降低至20%。使用Fluo-4钙指示剂的荧光显微镜分析显示，OGD/R刺激显著增加了PC12细胞的荧光强度，表明钙稳态被破坏。然而，SME预处理有效地消除了Fluo-4荧光信号，这表明SME有助于维持神经细胞中的钙平衡。此外，缺血和缺氧影响线粒体功能。线粒体超微结构透射电镜检查显示，OGD/R条件下细胞出现结构损伤，如肿胀和膜边界模糊。相比之下，SME处理的细胞表现出明显的保护作用，保持了相对完整的线粒体膜结构。这些发现表明，SME对缺氧缺血性损伤具有线粒体保护作用，从而提供神经保护。

在体内实验中，神经功能缺损评分显示，SME治疗组的预后显著改善，与MCAO组相比，神经功能预后更好。脑组织切片的尼氏染色显示，SME处理组神经元结构的保存增强。H&E染色组织学评价显示，SME预处理可减轻缺血损伤，减轻组织坏死，保持细胞完整性，进一步证实了SME的神经保护作用。TUNEL荧光与NeuN免疫染色共定位图像显示MCAO组绿色和红色荧光重叠，提示神经元凋亡。相比之下，SME预处理可减轻大鼠脑缺血损伤，减轻组织坏死，维持细胞完整性，减少神经元凋亡。全面的体外和体内实验为SME对IS损伤的神经保护作用提供了强有力的证据，验证了其治疗IS的潜在疗效。

SME的虚拟筛选（VS）与目标预测

结合丹参提取物（SME）的结构特征和生物活性特征，利用VS技术获得SME中生物活性物质的综合靶点信息。在已知SME化学剖面的基础上，利用VS获得全面的目标信息，包括SwissTargetPrediction和Similarity Ensemble Approach (SEA)（图4A）。这些工具根据SME化合物与已知生物活性分子的结构相似性来识别潜在靶标。筛选后，126个具有PubChem CID号的SME化合物使用在线平台进行目标预测。该方法得到310个候选靶蛋白，其概率和最大谷本系数均大于0.6，表明对预测关联的高可信度。通过整合结构相似性筛选获得的靶点信息和多维生物相似性分析，126个SME化合物共鉴定出281个潜在靶点蛋白。此外，该研究将已确定的潜在靶点与DisGeNET数据库交叉引用，使用“缺血性卒中”作为关键字，以查明与该疾病治疗相关的重叠靶点。这种综合方法确定了29个可能参与SME对抗IS作用机制的共同靶点。

VS靶点的富集分析与分子对接

为了对基于SME成分结构和生物学相似性识别的靶标进行比较分析，本研究对两组靶标进行了GO富集分析。通过SME组分结构相似性确定的63个靶点主要分别与BP、CC和MF类别的炎症反应、膜筏和核受体活性的调节有关。相反，通过SME组分的生物学相似性确定的74个靶点主要与对外源刺激、膜筏和血红素结合的反应有关。对比两种方法所识别的靶标，发现两种方法都不能完全捕获所有IS相关的目标信息。为了解决这一问题，该研究对29个重叠靶点进行了富集分析，这些重叠靶点是由结构和生物学上相似的靶点与IS相关靶点交叉产生的。富集分析表明，SME可能通过调节炎症反应、细胞外基质和丝氨酸水解酶活性来影响IS的进展。另外，对29个潜在靶蛋白进行KEGG通路富集分析。

随后，为了研究这些靶蛋白的作用和相互作用，作者进行了蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析。对29个靶蛋白的进一步PPI分析表明，APP、STAT3、PTGS2、MMP9和MMP2是最中心和高度连接的蛋白，表明它们具有关键的生物学功能。为了进一步评估SME化合物与29个目标蛋白之间的结合相互作用，进行了批量分子对接。与天然底物相比，SME化合物芹菜素与APP的结合更强，表明其潜在的竞争性结合和蛋白质功能的调节。

利用PISA方法鉴定SME的直接相互作用靶蛋白

为了有效筛选SME中与生物活性化合物结合的蛋白质，本研究采用了一种简化的CETSA（细胞热移试验）方法PISA。根据原始MS数据，鉴定出2,411个蛋白质，其中1,468个（60.9%）含有两个以上的独特肽，表明数据质量高。最终获得了100种差异蛋白，其中86种在处理后表现出显著提高的热稳定性。APP也被发现具有更高的热稳定性。对鉴定的靶蛋白进行功能分类，发现与自噬途径相关的蛋白显著富集，KEGG通路分析证实了这一点。

利用多剂量代谢组学方法鉴定SME靶蛋白

在本研究中，代谢组学主成分分析（PCA）结果显示，OGD、对照组和SME处理组之间存在显著分离，表明SME对PC12细胞代谢有实质性影响。特定药物反应的ED50可以通过筛选随SME剂量变化的代谢物来确定。例如，在焦谷氨酸、l -谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）的水平中观察到相反的趋势。综上所述，在较低浓度下，SME可有效抑制OPLAH酶活性，导致焦谷氨酸的积累和L-谷氨酸的产生减少。然而，在较高的SME浓度下，由于GAD67活性或表达的增加，GABA的产生可能保持不变。此外，参与GLUL和SMS介导的可逆反应的代谢物，如L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、亚精胺和精胺，均表现出相似的EC50值，证实了这些代谢过程的可逆性。

SME调节剂量依赖性代谢酶的生物信息学分析

通过预归一化和剂量-反应趋势代谢物绘制，进一步鉴定出82个代谢物。使用MetaboAnalyst平台进一步分析了82种剂量改变的代谢物，确定了与78种代谢酶靶点的关联。

78种代谢酶的PPI网络揭示了这些酶之间复杂的相互作用。为了识别网络内紧密连接的区域或簇，并识别功能相关的代谢酶簇，应用MCODE算法对PPI网络进行进一步分析。分析筛选了一个由9个高度相互连接的酶组成的绿色集群，GLUL是中心节点。

验证SME与靶蛋白之间的相互作用

在三种方法识别出不同的靶标之后，整合和选择合适的靶标进行验证。GO分析显示，氨基酸代谢过程和核苷磷酸代谢过程发挥重要作用。KEGG通路富集分析揭示了与卒中病理密切相关的几种代谢通路，包括嘧啶代谢、谷胱甘肽代谢、辅助因子的生物合成和HIF-1信号通路等。这些发现表明，这些途径可能显著促进了SME对缺血性脑损伤的潜在保护作用。

利用生物信息学和系统分析，选择了与SME治疗IS相关的蛋白质集合。通过各种靶点筛选方法鉴定出的5个蛋白，包括STAT3、PARP1、APP、GAD67和GLUL，它们是PPI网络的核心，作者选择它们进行实验验证。随后，采用DARTS技术结合WB分析验证和量化SME组分与潜在靶蛋白的直接结合。

进行分子对接实验，研究SME中鉴定的126个小分子与5个靶蛋白（APP、GLUL、STAT3、GAD67和PARP1）的相互作用。为了验证分子对接结果并评估蛋白质-配体结合的稳定性，对对接得分最低的蛋白质-小分子复合物进行了分子动力学模拟。

文章小结

总之，该研究提出了一种新的综合性研究策略，能够更全面、准确地识别和验证自然产物中的生物活性成分及其作用靶点，对于推动自然产物药物研究和开发具有重要意义。

想通过中药或者天然产物入手研究，但思路匮乏或者技术上难以复现的小伙伴们可以来找小云，方案设计和生信分析有我无忧！

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