Adv Sci新发!当单细胞+空间转录组遇上了“铁死亡”——创新思路仅凭3+3样本登上顶刊！

学术 2024-11-17 10:02 上海

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今天，小云带大家看一篇本月14号发表在Advanced Science （IF 14.3）的单细胞测序+空间转录组研究。文章通过整合单细胞测序和空间分辨率转录组学，研究乳头状甲状腺癌的空间异质性和演化路径，该研究只用到2名患者（3+3例样本），如此少的样本量还能顶上AS，如果没有一个创新思路，实属不易。不想错过的小伙伴跟着小云往下看吧~对单细胞+空转整合分析感兴趣的可以直接来找小云，无论公开数据还是自测数据，小云都可以为您量身定制~想自学的宝子可以看一下我们的云生信课堂：

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题目：空间和单细胞转录组学揭示了甲状腺乳头状癌的空间进化

杂志：Advanced Science （IF 14.3）

发表时间：2024.11.14

关注公众号，后台发送“123”可以直接获取原文PDF，文献编号：241117

研究背景

复发和转移是甲状腺乳头状癌（PTC）的主要问题。目前的形态学和分子分类系统分别由于缺乏变异特异性形态学标准和基于突变的诊断高信噪比而不能满足PTC的诊断。重要的是，目前的分子分类系统在很大程度上丢失了肿瘤内的异质性，这可以通过scRNA-seq来解决。然而，scRNA-seq丢失了空间信息和形态特征。该研究整合了scRNA-seq和空间分辨的转录组学（SRT），通过转录组和局部形态的关联来阐述PTC的空间异质性、恶性和转移的机制。

研究思路

研究结果

原发性PTC组织中存在较大的空间异质性

从一名淋巴结转移的PTC患者（记为患者1）和另一名无转移的PTC患者（记为患者2）中收集了6个样本；这两例患者均存在BRAFV600E突变。对于每位患者，收集原发肿瘤组织（分别记为肿瘤#1和#2），匹配的癌旁组织（分别记为Para#1和#2）和淋巴结组织（分别记为Para#1和#2）并进行scRNA-seq分析。两名患者的肿瘤和癌旁组织也进行了SRT分析。

共有21060个细胞和17601个基因在scRNA-seq中通过质量控制，通过细胞标记进一步注释成22个主要的细胞簇。这些细胞簇分为五类：T细胞、B细胞、骨髓细胞、基质细胞，以及上皮细胞和PTC细胞的混合簇（记为上皮和PTC）。

结合基因标记标注策略，将scRNA-seq标注的细胞簇投射到SRT的斑点簇上后，66.3%-83.5%的斑点被分类为上皮或PTC斑点。

根据组织学特征和无监督聚类，将PTC斑点分为6个主要形态学斑点簇（C1-C6），其中C2-4只存在于#1肿瘤组织中，C5-6只存在于#2肿瘤组织中。PTC斑点在#1和#2肿瘤组织中呈交错分布模式，特别是在1号肿瘤组织中。#1肿瘤组织的C3和#2肿瘤组织的C6具有典型的PTC特征，乳头状纤维化核心周围有恶性上皮细胞，提示C3和C6斑点的细胞为典型的恶性PTC细胞。

PTC在原发性转移组织中的多种进化途径

与相应的上皮细胞簇相比，scRNA-seq的PTC细胞和SRT的PTC点的注释具有更高的甲状腺肿瘤基因集得分和更低的正常基因集得分。

然后对所有PTC点簇进行空间轨迹推断分析，构建PTC细胞的空间进化路线，阐述肿瘤1号组织中PTC细胞的驱动机制。观察到两条空间进化路径，其中位于肿瘤组织边缘的一组上皮细胞进化为C3簇，而来自C1簇的大部分PTC细胞进化为C4簇。选择与空间进化路线相关的PTC点区域，并将其标记为感兴趣区域（ROI），以识别每条进化路线的驱动基因和信号通路。在上皮化ROI→C3过程中，三羧酸（TCA）循环、呼吸电子传递、复合体I生物发生、三磷酸腺苷（ATP）合成和I类MHC介导的抗原呈递显著上调，而mRNA翻译、蛋白质合成和无义介导的RNA衰变显著下调。此外，受抑制的mRNA翻译可能由GCN2介导，以响应氨基酸缺乏。在C1_ROI→C4过程中，所有驱动基因都是下调的基因。

不同基因足迹与PTC细胞恶性转移的关系

为了追踪患者1淋巴结转移性PTC细胞的来源，只选择了来自scRNA-seq的上皮细胞和PTC细胞，作为对照细胞，反向投射SRT鉴定的患者1的上皮细胞和PTC斑点。#1肿瘤和#1节点（#1患者的淋巴结组织）组织中的PTC细胞大部分投射为C3斑点。然而，在SRT分析（Set1）中#1肿瘤组织中原始C3斑点（Set2）、scRNA-seq分析中#1肿瘤组织中预测C3斑点（Set2）和#1节点组织（Set3）中，显著差异表达基因（DEGs）是不同的。这三组基因足迹中存在有限的重叠基因。

因此，选择Set1和Set2之间重叠的18个基因作为恶性足迹，而Set3与Set1和Set2之间不重叠的16个基因作为转移足迹。功能分析显示，恶性和转移性足迹主要涉及ECM重塑、细胞器功能和细胞-细胞相互作用。转移性足迹涉及内质网应激和抗原呈递。

免疫荧光分析显示，与Para #1相比，肿瘤#1中的Midkine （MDK）蛋白含量增加，MDK是这两个足迹中最高的DEGs之一；然而，与Para#2相比，肿瘤#2中MDK蛋白含量下降。接下来，利用B-CPAP细胞（一种BRAFV600E突变的细胞系）验证了MDK对ptc肿瘤和铁死亡的影响。首先，使用小干扰RNA （siRNA）敲低MDK的表达。伤口愈合实验和Trans-well实验表明，MDK表达下调显著损害了B-CPAP细胞的迁移和侵袭能力。此外，MDK敲低显著增强了经典铁死亡诱导剂RSL3诱导的细胞活力下降。

使用来自TCGA的甲状腺癌（THCA）数据集也测试了恶性和转移性足迹的临床价值。甲状腺癌患者的恶性与转移呈显著正相关。与正常样本相比，BRAF样甲状腺癌样本的恶性和转移足迹均显著增加。

抗铁死亡对PTC进化有贡献

恶性和转移足迹之间脂质代谢的不同富集可能涉及铁死亡抑制；还发现RSL3可以降低PTC细胞的活力。因此，作者从公共数据库FerrDb中筛选了39个铁死亡标记基因，并首次分析了这39个标记基因在TCGA数据库THCA数据集中的表达情况。这39个基因的表达水平可以很好地区分正常甲状腺组织、瘤周组织和肿瘤组织。进一步分析发现，这些铁死亡垂标记基因在甲状腺组织中的表达水平明显低于正常组织。对THCA数据集的分析还发现，与正常组织相比，GPX4在BRAF和RAS甲状腺癌组织中的表达水平均显著上调，而FTH1在BRAF甲状腺癌组织中的表达也显著上调。

重要的是，作者观察到肿瘤#1中39个铁死亡标记基因的表达与Para#1相比受到抑制。然而，与Para#2相比，这些铁死亡标记基因的表达在肿瘤#2中轻度上调。与Para 1相比，在肿瘤#1中观察到GPX4和FTH1的表达水平升高，而在肿瘤#2中与Para 2相比没有升高。这些结果表明，对铁死亡的抵抗可能促进了PTC细胞的进化。

文章小结

总之，研究结果表明，PTC细胞在原发性PTC淋巴结转移组织中具有更大的空间异质性和多种空间进化途径。发现两个基因足迹与PTC的恶性和转移密切相关。对铁死亡的抵抗可能有助于PTC的进化。

看完这篇文章不用小云多说了吧！单细胞就是这么给力，想发高分咱们可以做测序，不想测序的可以作为常规生信分析的加分项！如果你对单细胞分析感兴趣但不知道如何用在自己的课题中，或者想定制个性化分析思路的小伙伴，随时滴滴小云！

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