脂肪酸对延边牛前体脂肪细胞UCP1、UCP3的mRNA表达的影响

解偶联蛋白1（UCP1）和解偶联蛋白3（UCP3）是线粒体跨膜蛋白家族中的成员，参与能量代谢和热量产生的调控过程。寒冷作为一种生理刺激可诱导细胞中的UCP1 的激活[1]，从而产热来应对来自外界的寒冷应激。UCP3基因作为多数动物抗寒的候选基因之一，在分子生物学研究领域一直是关注的焦点。研究发现，UCP3 与能量、脂肪酸代谢有关[2]，UCP3 的所有功能都高度依赖于细胞能量代谢，由于缺乏UCP3，仓鼠的耐寒性降低，同时棕色脂肪组织的代谢基因表达也降低[3]。如果敲除小鼠的UCP1，则UCP3 的丰度会下降[4]，表明UCP3 和UCP1 表达之间存在直接相关性。赵丹等[5]证明，UCP1基因的表达水平可能与牦牛肌内脂肪沉积有关。而延边牛肉多呈现出大理石花纹，其原因是延边牛肉的不饱和脂肪酸含量较高[6]。研究表明，油酸可以调节脂质代谢相关基因的表达，油酸作为长链脂肪酸中较为重要的十八碳烯酸，对牛的脂肪沉积具有促进作用，且与其他长链脂肪酸相比，油酸可以更快地促进细胞中脂质的合成[7]。Quan等[8]探讨人参提取物（GE）对肠道菌群的潜在调节作用，试验中发现，肠道球菌产生的肉豆蔻油酸可以提高UCP1的表达。单不饱和脂肪酸既构成了脂肪的基本单位，又与肌内脂肪的形成有着密不可分的关系，而延边牛肉中富含单不饱和脂肪酸，与抗寒性能是否有关尚未研究，且有关冷应激的研究大多只是从宏观上阐述影响因素和措施，而在细胞水平上进行相关分子机制的研究报道并不多。细胞分子水平的变化是机体各种生理反应的基础，对细胞冷应激相关基因的研究有助于深入理解冷应激对机体影响的生物学机制。关于细胞冷应激的研究多集中在医学领域无限细胞系，对畜禽等有限细胞系研究相对较少，且对延边牛前体脂肪细胞的研究尚未见报道。

试验通过研究单不饱和脂肪酸中油酸（OA）和肉豆蔻油酸（MOA）对延边牛前体脂肪细胞冷应激前UCP1、UCP3 基因表达以及脂滴生成情况的影响，着重研究其在不同冷应激时间下对UCP1、UCP3基因表达的调节作用，旨在阐明油酸和肉豆蔻油酸在冷应激下对延边牛前体脂肪细胞UCP1 和UCP3 mRNA 表达的调控机制，为进一步深入研究延边牛前体脂肪细胞在冷应激后的生物学变化提供基础数据。

1.1 试验材料

3 头20 月龄的延边牛，由吉林省延边州龙井市德海牧场提供。用无菌手术刀取皮下脂肪组织立即放入含有青链霉素混合液（PS 100×）的无钙镁磷酸盐缓冲液（PBS）中，并置于冰盒内迅速运回实验室进行细胞分离与培养。

1.2 试验试剂

RNA反转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒、cDNA第一链合成预混试剂、PCR 扩增2×TaqPCR 预混试剂Ⅱ，购自天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、氨苄青霉素、琼脂糖，购自天根生化科技（北京）有限公司；DMEM/F12（1∶1）培养基、胰蛋白酶0.25%、EDTA 0.02%、胎牛血清（FBS）、马血清、青链霉素混合液（PS 100×）、油红O 染色液、三酰甘油测定试剂盒、新型总RNA 抽提试剂（Trizol Reagent），购自Applygen Technologies公司。

1.3 药品的配制

细胞培养液：4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（HEPES）+2 g 碳酸氢钠+1 L 高糖培养基（DMEM）；清洗液：1%青链霉素混合液（PS 100×）+磷酸缓冲盐溶液（PBS）；消化液：高糖培养基（DMEM）+1%青链霉素混合液（PS 100×）+2 mg/mL 胶原酶（Collagenase）+1%牛血清白蛋白（BSA）；分离用培养液：10% FBS+3%青链霉素混合液（PS 100×）+87% DMEM；完全培养液：10% FBS+1%青链霉素混合液（PS 100×）+89% DMEM；5% BSA：2.00 g BSA+40 mL 磷酸缓冲盐溶液（PBS）；胶原酶消化液：2.00 g BSA+0.10 g的Ⅰ型胶原酶+10 mL DMEM。

1.4 方法

1.4.1 延边牛前体脂肪细胞的分离与培养

将延边牛脂肪组织在磷酸盐缓冲液[加3%青链霉素混合液（PS 100×）]中清洗5～6 次，除去血管和筋膜，再将组织剪碎。随后加入2 mg/mL 胶原酶Ⅰ+1%BSA+1%青链霉素混合液（PS 100×），在37 ℃水浴锅中消化1.5 h，每隔5 min振荡1次。消化完成后，向离心管中加入相等体积的培养液，过滤到另一个无菌离心管中并转移至离心机，1 500 r/min 离心10 min，吸取上清液丢弃。取10 mL 的PBS 悬浮沉淀，用孔径为70 µmol/L的细胞筛过滤，再以1 500 r/min离心10 min，去除上清后用完全培养液悬浮沉淀获得延边牛前体脂肪细胞。将前体脂肪细胞接种到培养液中，并在95%的空气、5% CO2和37 ℃的培养箱中进行培养，培养液每2 d 更换1 次，当细胞汇合度达到70%～80%时进行传代。

1.4.2 前体脂肪细胞的传代培养

传代前吸出原培养液并用PBS清洗3次，取0.25%胰蛋白酶加入培养皿中，移至37 ℃恒温培养箱中静置2 min。在显微镜下可观察前体脂肪细胞的形态。大多数细胞消化后，用移液枪反复吹打数次使细胞全部脱落，加入2 mL的完全培养液制成细胞悬液。将细胞悬液放置离心机内，1 500 r/min 离心5 min，随后弃去上清液并加入完全培养液使细胞悬浮，传至新的培养皿。

1.4.3 前体脂肪细胞的生长曲线绘制

待前体脂肪细胞生长密度达到70%～80%时，使用无菌PBS 轻缓清洗细胞3 次，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶后放置在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育3 min。取出后，以5×103个/孔接种于96 孔板中，分为8 组，每组3 个重复，先选取1 组细胞加入20 µL MTS 细胞活性测定试剂，37 ℃、5% CO2培养箱中孵育3 h, 测定每孔细胞在490 nm 处的吸光度（OD）值，测3 次取平均值。之后每隔24 h 取1 组细胞按照上述方法测定。连续检测7 d, 绘制延边牛前体脂肪细胞生长曲线。

1.4.4 OA、MOA对前体脂肪细胞的处理

经过多次试验和比较，100 µmol/L 的OA 和MOA诱导延边牛前体脂肪细胞96 h分化效果最佳，且该浓度与先前研究结果相一致[9-10]。试验中，当6 孔板中的细胞密度达到90%以上时对细胞进行处理，试验分为3 组，对照组（CON）：只添加正常培养液（高糖培养基DMEM+2%马血清HS+1%青霉素-链霉素溶液PS）；油酸处理组（OA）：在正常培养基中添加100 µmol/L的OA；肉豆蔻油酸处理组（MOA）：在分化培养基中添加100 µmol/L的MOA。对每组处理96 h。

1.4.5 三酰甘油浓度的测定

利用三酰甘油测定试剂盒对三酰甘油的浓度进行测定，首先将细胞利用PBS洗涤2次，随后用胰蛋白酶进行消化，消化结束后加入等量的完全培养液终止消化，用移液枪反复轻轻吹扫细胞使之脱落，转至离心机内1 500 r/min 离心5 min，将上清液丢弃，并利用PBS 洗涤后再次1 500 r/min 离心5 min，将上清液丢弃，并加入200 µL 的裂解液于离心管中，将其混匀后室温静止10 min，细胞裂解液上清转移至新离心管中，在70 ℃环境下培养10 min，转至离心机内以2 000 r/min 离心5 min，吸取上清液丢弃。将预先用PBS 稀释后的甘油标准品标准液及待测样品各吸取10 µL 加入到96 孔板，随后放入37 ℃培养箱中培养10 min，测定各孔在570 nm 处的OD 值，绘制标准曲线计算甘油浓度。

1.4.6 油红O染色

按照油红O 染色试剂盒提供的方法，将培养的细胞进行一系列处理并加入油红O 染色液进行密闭染色，晾干待镜检。

1.4.7 细胞低温培养

取培养96 h的3组细胞（OA组、MOA组、CON组）用于4 ℃冷应激试验，在试验前24 h 给细胞进行换液，并将其从培养箱中转移至4 ℃环境中冷处理0、6、12、24 h。随后收集各处理组的细胞，对其进行相关检测。

1.4.8 实时荧光定量PCR及数据分析

将处理的细胞用新型总RNA抽提试剂（Trizol Reagent）提取RNA，并反转录成cDNA用于荧光定量检测，引物见表1。以GAPDH为内参基因进行qRT-PCR分析已处理细胞的UCP1、UCP3基因的相对表达量，20 µL反应体系：上、下游引物各0.6 µL（10 pmol/µL），50×Rox Reference Dye 0.3 µL，RNase-free ddH2O 7.5 µL，cDNA 模板1 µL（1 µg/µL），2×SuperReal Premixplus 10 µL。每个待测样品3个重复，PCR 反应程序：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性10 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，共40个循环；95 ℃变性15 s， 60 ℃反应1 min；95 ℃变性15 s。

运用2-ΔΔCt 法对所得数据进行分析，利用SPSS 19.0 软件对UCP1、UCP3 基因的表达水平进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异显著性判断标准。

2.1 延边牛前体脂肪细胞的生长曲线

根据测定结果绘制延边牛前体脂肪细胞的生长曲线（见图1），可以观察到延边牛前体脂肪细胞的生长趋势为典型的“S”型。细胞生长曲线表明，本试验分离和培养的延边牛前体脂肪细胞符合正常细胞的生长规律，可用于后续试验。

2.2 不同脂肪酸处理对延边牛前体脂肪细胞的影响

MOA、OA处理前体脂肪细胞96 h后，如图2（a）所示，CON组除可观察到被染成蓝色的细胞核外，未发现有脂滴形成。但OA组及MOA组均在分化96 h后可观察到细胞核周围红色脂滴，细胞边界也已变得不再清晰，且OA组红色脂滴明显多于MOA组。如图2（b）所示，OA、MOA处理96 h后发现细胞内的三酰甘油的含量逐渐升高，OA组和MOA组三酰甘油含量均显著高于CON组，且OA组的三酰甘油含量显著高于MOA组（P＜0.05）。

注：柱顶标注不含有相同小写字母表示差异显著（P＜0.05），含有相同字母或无字母表示差异不显著（P＞0.05）；下图同。

图2 不同脂肪酸处理对延边牛前体脂肪细胞的影响

2.3 不同脂肪酸处理对延边牛前体脂肪细胞抗寒基因表达的影响

不同脂肪酸处理前体脂肪细胞96 h 后，如图3 所示，OA、MOA 组与CON 组相比均可显著降低UCP1 和UCP3 基因表达水平，并且MOA 组相比较于OA 组可显著降低UCP3基因的表达量（P＜0.05）。

图3 不同脂肪酸处理对延边牛前体脂肪细胞UCP1及UCP3基因表达的影响

2.4 冷处理时长对不同脂肪酸处理脂肪细胞UCP1、UCP3基因表达的影响

分别对3 组细胞进行冷应激处理0、6、12、24 h，如图4所示，冷处理0～6 h的前体脂肪细胞3组试验中UCP1 基因的表达量均未发生显著性变化（P＞0.05），在冷处理6～24 h 的前体脂肪细胞UCP1 的表达量发生显著性上升（P＜0.05），6～12 h 各组间UCP1 表达量无显著变化（P＞0.05），12～24 h各组间UCP1表达量差异显著，且各组在24 h 表达量最高（P＜0.05）。据图4比对分析，CON 组的UCP1 表达量显著高于OA、MOA组，MOA 组显著低于OA 组（P＜0.05），说明OA 与MOA在一定时间范围内对冷应激的前体脂肪UCP1表达在不同程度上有抑制作用。如图5 所示，冷处理0～6 h的前体脂肪细胞UCP3 表达量无显著变化（P＞0.05），而在冷处理6～12 h 的前体脂肪细胞UCP3 表达量发生显著性降低（P＜0.05），并且各组间无显著变化（P＞0.05），12～24 h 的3 组处理中UCP3 表达量均未发生显著性变化（P＞0.05）。据图5比对分析，UCP3的表达量随着冷应激处理时间的延长而降低，OA、MOA组表达量低于对照组，说明OA 与MOA 在一定时间范围内对冷应激的前体脂肪细胞UCP3表达在不同程度上有抑制作用。

图4 不同时间冷处理对不同脂肪酸处理脂肪细胞UCP1表达水平的影响

图5 不同时间冷处理对不同脂肪酸处理脂肪细胞UCP3表达水平的影响

脂肪酸可分为饱和脂肪酸（Saturated fatty acids，SFAs）和不饱和脂肪酸（Unsaturated fatty acids，UFAs）。其可以作为能量底物、细胞膜（磷脂）的结构成分和第二信使，同时脂肪酸也是影响基因表达的核受体的配体[11]。李泽廷[12]研究发现，外源性添加OA 处理奶牛乳腺上皮细胞可促进三酰甘油的合成，本试验应用OA、MOA 处理前体脂肪细胞96 h，处理组前体脂肪细胞的脂滴数目、三酰甘油含量均大于CON 组。机制是外源性添加的OA 和MOA 参与脂质合成途径，激活甘油磷酸脂合成酶等的活性，使前体脂肪细胞脂滴生成及TAG 含量增加[13-14]。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）等转录因子作为调控脂质代谢和脂滴生成的关键调节因子，其表达及活性可能被OA 和MOA影响，从而进一步促进脂滴及TAG合成[15-16]。与MOA 相比，OA 更能有效地促进脂滴和TAG 的形成。可能因为OA 是细胞内脂滴的主要成分之一，较MOA更能激活脂滴生成相关的信号传导途径，改善细胞膜流动性，有效促进囊泡融合和脂滴生长[17]。

解偶联蛋白（UCP）是位于线粒体内膜的蛋白质家族的成员。这些蛋白质参与调节能量消耗、产热和游离脂肪酸，同时影响活性氧水平[18]。据报道，脂肪酸可以通过影响如PPAR-γ 和PCG-1α 等转录因子的活性来调节UCP1、UCP3的表达，同时也参与线粒体功能，影响内部偶联过程和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的产生[19-20]。本试验中,OA 和MOA 处理前体脂肪细胞后，与CON 组相比显著降低UCP1、UCP3 的mRNA 水平。这提示添加的外源性脂肪酸（OA 和MOA）可能抑制PPAR-γ的活性和AMP 依赖的蛋白激酶（AMPK）能量感应信号通路的活性来降低UCP1 和UCP3 的基因表达。MOA组更显著抑制UCP1和UCP3表达，原因可能是对细胞的特定信号通路（如PPAR-γ和AMPK）有更强的抑制作用。MOA 也可能更有效地改变线粒体功能，导致对解偶联蛋白（UCP）的依赖减少。

UCP1 存在于褐色脂肪组织（BAT）中，位于线粒体内膜上，主要功能是通过促进热量的产生来维持体温[21]。已有研究表明，在冷诱导下会使BAT 细胞中UCP1 被激活并以脂肪为底物氧化分解产生热能[22]。本试验中，随着冷应激处理时间延长，前体脂肪细胞中UCP1 的表达呈上升趋势，且各组（OA、MOA、CON组）在24 h UCP1 表达量最高。这一结果表明，冷应激可能激活了前体脂肪细胞内蛋白激酶A（PKA），进而促进cAMP 响应元件结合蛋白（CREB）、PPAR-γ 等转录因子的活化，这些转录因子提高了UCP1 基因的转录活性，加速细胞产热并维持细胞的正常生理活动[23-24]。同时，低温也诱导前体脂肪细胞向褐色脂肪细胞的分化，并伴随着UCP1 及其他褐色脂肪特异性基因的表达增加[25]。另外，外源性添加OA 和MOA，可进入细胞转变成脂滴，为细胞提供了额外的能量源。这可能导致冷应激下与未处理组相比降低了对UCP1 介导的热量产生依赖。此外，在肉牛中，OA 含量与肌内脂肪含量呈正相关。由于延边牛的肌肉脂肪含量较高，其中OA 和MOA 起主要作用，其结果也可能由于外源性添加OA、MOA 抑制了UCP1 的表达从而降低了机体对三酰甘油消耗，从而与肌内脂肪的形成有某种程度的关联。

UCP3 是一种线粒体阴离子载体蛋白，主要在脂肪组织、骨骼肌和心脏中表达[26]。Lin 等[27]研究指出当UCP1 缺乏的情况下，UCP3 可能是耐寒(藏猪)猪产热的重要介质，颠覆了UCP1 是唯一产热解偶联蛋白的传统观念。本试验中，随着冷应激时间增加，UCP3的表达呈下降趋势，在6～12 h发生了显著性降低。这一现象可能表明，UCP1和UCP3在前体脂肪细胞中存在某种负反馈机制[28]，冷应激刺激了UCP1的表达，可能满足了产热需要，而UCP3因其补偿机制，表达量随着UCP1的表达量增加而有所降低。尽管如此，UCP3具体的作用机制需要进一步研究来确认。王阳等[29]研究发现，贵州猪骨骼肌细胞中UCP3 表达量低可能导致细胞内游离的脂肪酸分解量降低，能量消耗减少，因此有较多的游离脂肪酸进入血液中，增加了合成三酰甘油的概率，有利于脂肪的沉积。据此，UCP3的表达可能与肌内脂肪的形成存在某种关联。

① 不同脂肪酸处理前体脂肪细胞96 h 后，OA、MOA组的UCP1和UCP3基因表达水平显著降低，并且MOA组相比较于OA组可显著降低UCP3的表达量。

② 培养96 h的前体脂肪细胞冷处理0、6、12、24 h后，在冷处理6～24 h前体脂肪细胞 UCP1的表达量发生显著性上升，且各组在24 h表达量最高。而在冷处理6～12 h UCP3表达量发生显著性降低。

③ OA 与MOA 在一定时间范围内对冷应激的前体脂肪UCP1、UCP3表达存在不同程度的抑制作用。

参考文献及更多内容详见：

饲料工业，2024，45（15）：80-86

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