黄粉虫粉作为饲料蛋白源对草鱼摄食和生长的影响研究

在全球粮食蛋白源紧张和水产养殖饲料对蛋白源消耗逐步增加的双重压力下，寻找新型非粮食蛋白质已成为水产养殖可持续发展研究领域中的重要课题。新型蛋白源除了应具备营养平衡、价格便宜和易获得等特点外，鱼类对蛋白源的喜好程度通常是筛选新型蛋白时优先考虑的因素。

昆虫粉蛋白较传统的动物型和植物型蛋白而言，被认为是水产饲料中最有开发潜力的新型非粮食蛋白。但据研究报道，舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）[1]、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）[2]和短棘鮰（Ameiurus melas）[3]等鱼虾对昆虫粉的喜好程度差异很大。黄粉虫易饲养、占地少，其风干产物的蛋白质含量高达60%，氨基酸平衡，同时含有较高的脂肪，为鱼类提供能量，故黄粉虫粉被认为是一种非常有潜力的优质昆虫蛋白源[4]。大多数关于黄粉虫粉在水产饲料中的报道认为其有较好的养殖效果[5-7]，但也有报道认为高含量的黄粉虫粉可导致鱼类的摄食和生长受阻，消化率降低[1]。

鱼类的摄食和蛋白源的类型及含量之间关系密切，如高植物蛋白含量的饲料会导致花鲈（Lateolabrax japonicus）[8]、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[9]和尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）[10]的采食量下降。与肉食性或杂食性鱼类相比，草鱼对植物型蛋白源的摄食喜好和利用程度具有较明显的优势[11]。鱼类对饲料中蛋白源的偏好和采食量的调节在很大程度上与神经调节机制相关。

在鱼类中，几种与摄食相关的神经肽，例如厌食神经肽[可卡因-安他非明转录调节肽（cocaine and amphetamine regulated transcript peptide, CART）和阿片促黑色素原（pro-opiomelanocortin, POMC）]及促食神经肽[神经肽Y（neuropeptide, NPY）和刺鼠关联肽（Agouti-related protein，AgRP）]已经被证实由下丘脑分泌并在自主神经和内分泌系统的神经元中产生反应以影响摄食行为[12-15]。Liang 等[8]的研究表明，植物性饲料会引起花鲈厌食反应并伴随着pomc基因表达量的变化。此外，研究发现舌齿鲈会拒食不含蛋白质的饲料[16]，但这种拒食行为的机制并不清楚。在哺乳动物中发现，日粮蛋白质缺乏会引起小鼠下丘脑中npy转录水平发生改变进而影响摄食量[17]。

草鱼作为我国重要的集约化淡水养殖品种，饲料蛋白质在其食物结构中至关重要。关于黄粉虫粉作为单一蛋白源在草鱼饲料中的研究还未见报道。本研究探讨了以黄粉虫粉为单一蛋白源时草鱼的生长和摄食反应，并比较其与豆粕为单一饲料蛋白源时的差异，从而为黄粉虫粉的饲料营养价值评定及其在草鱼饲料中的应用提供指导。

1.1 试验饲料

分别以黄粉虫粉和美国豆粕为饲料蛋白源，玉米淀粉为糖源，大豆油和鱼油为脂肪源配制了低蛋白（29%）和高蛋白（41%）水平的4 种饲料，分别记作黄粉虫粉低蛋白饲料（L-MW）、黄粉虫粉高蛋白饲料（H-MW）、豆粕低蛋白饲料（L-SM）和豆粕高蛋白饲料（H-SM），饲料配方组成及其营养水平见表1。饲料制作时，先将原料粉碎后过80 目筛，并称重混匀，然后用膨化机（饲料水分为21%，膨胀温度130 ℃）制成直径为2 mm 的颗粒，随后在烘箱中以60 ℃干燥30 min，并于-20 ℃冰箱中保存备用。

注：1.每千克豆粕的干物质中含有：粗蛋白512.46 g、粗脂肪11.46 g、灰分68.44 g；

2.每千克黄粉虫粉的干物质中含有：粗蛋白719.45 g、粗脂肪45.76g、灰分74.92 g；

3.维生素和矿物质预混料向每千克日粮提供：VC磷酸酯（35%）900 mg、VE 450 mg、肌醇225 mg、烟酸胺120 mg、泛酸钙60 mg、VA 30 mg、VK3 30 mg、VB2 22.5 mg、VB6 22.5 mg、VD3 15 mg、VB1 15 mg、叶酸15 mg、VB12 120 μg、生物素3 mg、一水硫酸铁300 mg、一水硫酸锌200 mg、氯化钠100 mg、一水硫酸锰25 mg、五水硫酸铜30 mg、氯化钴（10%钴）5 mg、亚硒酸钠（10%硒）5 mg、碘酸钾（2.9%）3 mg、硫酸镁900 mg；4.营养水平为实测值。

1.2 试验设计和管理

试验用草鱼幼鱼购自武汉市新洲渔场。正式饲养试验前，草鱼被投喂各试验饲料的混合物暂养14 d使其适应养殖环境。暂养结束后，挑选出体格健壮、规格一致[（6.8±0.1）g]的草鱼随机分入12 个养殖缸（直径为0.8 m，水体积为300 L，微流水养殖系统）中，每缸30 尾。将各缸鱼随机分组至每种饲料，每个处理3个重复。在56 d的养殖试验期间进行定时（8：00和15：00）饱食投喂，剩余残饵收集后烘干。养殖期间采用自然光照，水温为（28±1.5）℃、溶氧大于5 mg/L、pH为7.7左右、水流速为1.5 L/min。

1.3 样品采集和指标测定

试验结束时，将草鱼饥饿24 h后进行称重。然后从每缸中随机取3 尾草鱼，用MS-222 麻醉后解剖取出脑组织并置于液氮中速冻，再保存至-80 ℃直至下一步分析。

使用Trizol™试剂（TaKaRa）从脑组织中提取总RNA，然后用1%琼脂糖凝胶电泳和260/280 nm 吸光度比值（NanoDrop® ND-1000, Thermo Fisher Scientific, 美国）确定RNA 的质量和数量。用Prime Script™RT试剂盒（TaKaRa，日本）将总RNA逆转录为cDNA，并于-20 ℃保存备用。

通过NCBI数据库获取序列信息，并使用Oligo 7.0软件为npy、agrp、pomc和cart设计特异性引物（表2）。

表2 荧光定量引物序列

使用Unique Aptamer™qPCR SYBR® Green Master Mix（Novogene）试剂盒在罗氏荧光定量仪（Light Cycler 480Ⅱ，Roche）上进行qPCR检测分析。扩增程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，55 ℃退火20 s和72 ℃延伸20 s，40个循环。以ef1-α为内参，利用2-ΔΔCt的方法计算基因相对表达量。

1.4 嗅觉电生理测定

参照Yu等[18]方法测定草鱼对四种饲料的嗅觉电生理响应幅值。①将4种饲料分别称取10.0 g并溶于200 mL 脱氯自来水中30 min，然后用滤纸过滤并收集过滤液；②将记录电极（ME-1 微电极放大器，成都泰盟软件有限公司）接触于草鱼[（10.1±1.0）g]嗅囊表面，同时将参比电极接触于吻端；③以脱氯自来水为阴性对照，将响应幅度调整为0，随后将饲料溶解液在相等时间间隔内滴入嗅囊表面，共计滴入3 次，随后电信号通过BL-420A生物机能实验系统（成都泰盟软件有限公司）显示在计算机上并记录幅度值（幅度值=正电势最大值+负电势最大值的绝对值）。试验结束后将试验鱼放回水箱，整个试验使用了3尾草鱼进行重复测试。

1.5 指标计算及数据处理

试验鱼的平均摄食量（AFI，g）、增重率（WGR，%）、蛋白质效率（PER）和成活率（SR，%）按下列公式计算。

平均摄食量（AFI，g）=总干物质摄食质量/每缸鱼的数量

增重率（WGR，%）=100×（鱼体末重-鱼体初重）/鱼体初重

蛋白质效率（PER）=（鱼体末重-鱼体初重）/蛋白质摄入量

成活率（SR，%）=存活尾数/初始尾数×100

试验数据以“平均值±标准误（Mean±SE，n=3）”表示。通过双因素方差分析（two-way ANOVA）来分析各因素对观测指标的影响。当交互作用显著时，采用Duncan’s 法多重检验来评估各组之间的差异。若交互作用不显著，则仅在相同蛋白源内部或相同蛋白质水平之间进行独立样本t检验以比较各因素引起的差异大小。所有统计分析均采用SPSS 22.0 软件进行，P＜0.05表示差异显著。

2.1 饲料蛋白质水平和蛋白源类型对草鱼摄食和生长的影响

由表3 可知，草鱼对黄粉虫粉饲料的摄食非常少，仅在维持摄食量水平；两个黄粉虫饲料组的增重率极低，其中L-MW组为负值。双因素方差分析显示草鱼的平均摄食量、末重、增重率和蛋白质效率均受饲料蛋白源类型、蛋白质水平及二者之间的交互作用影响（P＜0.05）。黄粉虫粉为蛋白源时，L-MW 和HMW 组草鱼的平均摄食量和末重无显著差异（P＞0.05）；而H-MW 组的增重率和蛋白质效率相较于LMW 组显著提高（P＜0.05）。豆粕为蛋白源时，H-SM组末重、平均摄食量和增重率显著高于L-SM 组（P＜0.05），而蛋白质效率则显著降低（P＜0.05）。另外，与豆粕组（L-SM 和H-SM）相比，相同蛋白质水平下的黄粉虫粉饲料组（L-MW和H-MW）的平均摄食量、末重、增重率和蛋白质效率均显著降低（P＜0.05）。各组之间成活率无显著差异（P＞0.05）。

注：1.同列数据肩标不含有相同小写字母表示差异显著（P＜0.05），含有相同字母或无字母表示差异不显著（P＞0.05）；

2. P值表示双因素方差分析中各因素及其交互作用影响的显著性。

2.2 饲料蛋白源类型（黄粉虫粉和豆粕）及蛋白质水平对草鱼嗅觉电信号响应幅度的影响

由表4 可知，草鱼的嗅觉电信号响应幅度受饲料蛋白源、蛋白质水平及二者之间的交互作用影响（P＜0.05）。在黄粉虫粉饲料组间，L-MW 和H-MW组草鱼的嗅觉电信号响应幅度差异不显著（P＞0.05）；在豆粕饲料组间，H-SM 组嗅觉电信号响应幅度显著高于L-SM 组（P＜0.05）；另外黄粉虫粉饲料组的嗅觉电信号响应幅度均显著低于豆粕饲料组（P＜0.05）。

注：1.同行数据肩标不含有相同小写字母表示差异显著（P＜0.05），含有相同字母或无字母表示差异不显著（P＞0.05）；

2. P值表示双因素方差分析中各因素及其交互作用影响的显著性。

2.3 黄粉虫粉和豆粕蛋白源及蛋白水平对草鱼脑组织摄食相关基因表达的影响

如图1 所示，饲料蛋白源、蛋白质水平及二者之间的交互作用均不同程度影响草鱼脑组织中agrp 和pomc 的表达水平；npy 的表达也受饲料蛋白源种类及蛋白质水平的影响显著（P＜0.05），但二因子之间不存在交互作用（P＞0.05），抑食基因cart 的表达量则仅受饲料蛋白源种类的影响（P＜0.05）。促食基因agrp 的表达在黄粉虫粉饲料组（L-MW 和H-MW 组）最低，L-SM 饲料组居中，而H-SM 饲料组最高；抑食基因pomc的表达则与agrp的变化趋势相反，两个黄粉虫粉饲料组（L-MW 和H-MW 组）最高，其次为L-SM 饲料组，而H-SM 饲料组最低（P＜0.05）。t 检验结果显示，H-SM 组npy 表达量显著高于L-SM 组，而黄粉虫粉高、低蛋白含量组之间没有显著差异；在相同蛋白质水平下，黄粉虫粉组npy的表达量显著低于豆粕组，而cart表达量则呈相反趋势（P＜0.05）。

3.1 饲料蛋白源和蛋白水平对草鱼摄食、生长和嗅觉电信号的影响

大量研究表明，长期摄取高蛋白饲料增加了鱼类的采食量[19-20]，并因此促进了鱼类的快速生长。本试验豆粕组中，高蛋白组草鱼的采食量显著高于低蛋白组，且伴随末重和增重率的增加，这与罗非鱼[19]和草鱼[21]上的研究结果一致。鱼类可利用摄入的蛋白质作为能量来源以满足机体的能量消耗，剩余的蛋白质用于生长发育，从而较高的饲料豆粕蛋白质改善了草鱼的生长[22]。然而，本试验的草鱼对黄粉虫粉饲料采食量无差异，相对而言，草鱼摄食黄粉虫粉高蛋白饲料会获得更多的蛋白质，用于维持日常能量消耗和鱼体生长，而低蛋白饲料则不能维持本身能量消耗导致消瘦，因此导致了低蛋白黄粉虫粉组的草鱼体重减少和负的蛋白质效率。值得注意的是，在本研究中，黄粉虫粉组的摄食和生长远不如豆粕组，且低蛋白黄粉虫饲料组的生长为负值，都表明黄粉虫作为草鱼饲料的蛋白源可能引起草鱼的不适，这与之前在舌齿鲈中的结果相类似[1]。此外，蛋白源和蛋白水平的交互作用显著影响草鱼的生长和饲料摄取，这与Basto-Sliva等[23]的发现一致。

在很大程度上，鱼类对食物的喜好差异与嗅觉系统、味觉系统和消化生理有关。饲料的气味通常具有诱发鱼类搜索食物的作用，味道和质地最终决定了饲料的摄取[24]。本试验中，草鱼在养殖初期到结束过程中均表现出对黄粉虫粉饲料没有摄食偏好，甚至出现厌食情况，这种对特定蛋白源厌食行为在花鲈也有类似的报道[25]。我们前期的试验表明，部分L-型氨基酸和化学类物质（二甲基-β-乙酸噻啶和二甲基-β-丙酸噻啶）具有引诱并促进草鱼摄食的作用[18]。鱼类行为学和电生理学研究表明，多种化学物质可以被鱼类嗅觉系统所识别，并刺激鱼类的嗅觉系统，使鱼类产生特定的行为反应和嗅觉响应电信号[26]。通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）方法对黄粉虫粉的气味分析发现，黄粉虫粉的气味主要由碳氢化合物（50.11%）和醛类（37.14%）构成[27]，并且黄粉虫粉的氨基酸谱与豆粕和鱼粉具有明显的差别[28]。此外，植物性蛋白富含单糖、蔗糖和可溶性非淀粉多糖，并且草鱼对糖类物质具有偏好性[29]。为进一步证实黄粉虫粉饲料中某些物质抑制草鱼摄食的行为，我们通过测定嗅觉电信号发现草鱼对黄粉虫粉饲料的响应幅度显著低于豆粕饲料，尤其是高蛋白组豆粕饲料。值得注意的是，嗅觉电生理学试验不能区分哪些物质对鱼类具有吸引作用，只能模拟自然条件下某些物质对嗅觉的刺激强度[18]。因此，从摄食表现和嗅觉电信号的结果可推测黄粉虫粉的成分不能引起草鱼的摄食发生，但具体影响机制需进一步探究。

3.2 饲料蛋白源和蛋白水平对草鱼摄食基因的影响

鱼类摄食行为受到饲料主要的营养成分（即碳水化合物、脂肪和蛋白质）、水温、光照周期和水质的影响[30-31]，且涉及下丘脑和外周信号之间复杂相互作用[31]。有研究报道，鱼类摄食高蛋白饲料会增加采食量[15]，且伴随着摄食调控因子的变化[23]。大量研究表明，下丘脑在摄食上发挥重要作用，其可分泌促食欲神经肽（NPY 和AgRP）[14]和厌食神经肽（CART 和POMC）[12-13]。在虹鳟[13]和草鱼[32]中，CART 和POMC 已被证明参与抑制摄食行为。Chaumontet 等[33]报道，摄食高蛋白质食物下调了小鼠下丘脑中pomc基因的表达量。本试验结果表明，摄食高蛋白豆粕饲料降低了脑组织中pomc 相对表达量，促进摄食行为的发生。另外，关于西伯利亚鲟（Acipenser baerii）摄食的研究发现，CART与下丘脑中NPY受体能够相互作用[34]，从而促进对食物的摄入。NPY 作为硬骨鱼中促食欲调节肽，在草鱼[35]、鳜（Siniperca chuatsi）[36]、黄条鰤（Seriola aureovittata）[37]和金鱼[38]均有证明。Alam 等[36]试验表明，npy 和agrp 基因表达量随着饲料中P/E 比的增加而线性增加，与本试验脑组织中agrp的表达量在豆粕高蛋白组被上调一致，且npy 的表达量也有上调的趋势。基于以上结果，草鱼对不同蛋白水平饲料的摄食反应受到中枢神经系统中npy、agrp 和pomc 等摄食因子调节。

另一方面，鱼类对蛋白源选择的差异性与神经肽通过中枢神经系统发出的信号介导有关[39]。Liang等[15]认为下丘脑中促食基因agrp 的上调和厌食基因pomc的下调，导致了草鱼偏向于摄食植物性蛋白。本研究与以上结果类似，即草鱼脑组织中agrp上调并伴随着pomc下调促进了对豆粕饲料的摄食。Basto-Silva等[23]报道，金头鲷（Sparus aurata）摄食植物性蛋白的饲料降低了大脑中cart基因的表达。与之相反，花鲈摄食植物蛋白导致厌食基因pomc高水平的表达[8]，这与其肉食性的特点相符合。相应地，本试验中草鱼脑组织中agrp下调并伴随着pomc上调限制了对黄粉虫粉饲料的摄食，这也表明草鱼对黄粉虫粉饲料的摄食是受到上述基因的调控。因此，黄粉虫粉和豆粕蛋白源在很大程度上影响了草鱼脑组织中摄食因子相关基因的表达进而调节了其摄食行为。

饲料蛋白源类型和蛋白质水平能够影响草鱼的摄食、生长、嗅觉电信号幅度和部分摄食基因的表达，且二因子之间存在交互作用。通过摄食量、增重率、嗅觉电信号幅度及蛋白质效率判定，黄粉虫粉作为单一饲料蛋白源时对草鱼摄食和生长均产生负面影响。与豆粕饲料相比，黄粉虫粉饲料下调了npy 和agrp 的表达量，且上调了pomc 的表达量，导致草鱼的食欲抑制。这些结果表明黄粉虫粉作为草鱼饲料的蛋白质源时应谨慎操作，尤其不宜作为单一蛋白源在草鱼饲料中使用。

参考文献及更多内容详见：

饲料工业，2023，44（10）：74-80

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