多菌发酵挤压酱油渣生产蛋白饲料的工艺研究

学术   2024-10-25 11:14   辽宁  

作者:张海静   姜丽君   张 敏   杨 哲   邓雨欣   索文静   李宏军



导读:为了充分利用酱油生产的副产物,进行了混合菌种固态发酵挤压酱油渣制备蛋白饲料的研究。采用单因素和Box-Behnken试验设计,以真蛋白含量和粗纤维含量作为考察指标,研究了接种量、发酵温度、发酵时间和装瓶量对发酵产物的影响。结果表明最佳发酵工艺为:接种量16.6%,发酵温度36 ℃,发酵时间6 d和装瓶量10 g,在上述发酵条件下,发酵产物中真蛋白含量达到32.11%,粗纤维含量降低到16.82%,与未发酵前相比,真蛋白含量提高了30.5%,粗纤维含量降低了44.8%,并且粗蛋白含量达到36.55%。本研究采用混合菌种发酵挤压酱油渣,可提高发酵产物中真蛋白含量,同时降低了粗纤维含量,为酱油渣开发利用制备饲料提供理论依据。全文已在《饲料工业》2022年第4期刊出。



随着畜牧业的快速发展,动物饲料的匮乏成为主要的制约因素。因此,对工业废弃物进行开发利用作为蛋白饲料资源成为近些年饲料工业研究的重要热点,这不仅从根本上解决了环境污染问题,还从源头上解决了饲料短缺的问题[1]。以工业废弃物作为发酵底物,利用多种微生物进行发酵,可弥补饲料中缺乏的氨基酸种类,同时对饲料中的其他营养成分进行转化,如将大分子蛋白分解成小分子多肽;将纤维素、果胶分解成单糖或寡糖等,不仅提高了饲料的蛋白质含量,还产生一些有益活性物质,改善了饲料的风味,有利于动物消化吸收和利用,提高了动物的适口性和免疫力。

中国是传统的农业大国,据国家统计局数据显示,2020年全国酱油生产量高达700.8万吨,同比增长3%,若以每生产1 kg酱油就有0.67 kg含水75%的酱油渣计算,会产生400多万吨的酱油渣[2]。酱油渣中含有丰富的营养物质,如约20%~30%粗蛋白质,20%~30%粗纤维,8%~10%粗脂肪和丰富的大豆异黄酮等[3-4],具有作为动物饲料资源的潜力。目前对酱油渣的利用主要有利用脂肪酶脱酸制备生物催化剂[5],在超临界条件下制备生物柴油[3],对酱油渣中油脂、抗氧化活性物质的提取等[6-7]。酱油渣水分含量高易腐败,并且含有较高的粗纤维和粗蛋白,造成动物适口性和消化吸收率差,这些是影响酱油渣饲料化应用的重要限制因素。目前酱油渣发酵制备饲料主要通过单菌光照发酵[4]和双菌属混合发酵[8],发酵产物中蛋白质含量较低和粗纤维含量较高,不利于动物消化吸收。由于挤压技术能够很好地改善蛋白质的性质和纤维的结构组成,因此本试验采用挤压技术对酱油渣进行预处理,再通过多种菌属进行发酵来生产蛋白质饲料。

本研究旨在对挤压酱油渣制备蛋白饲料的发酵工艺条件优化。通过前期试验确定黑曲霉、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母和白地霉最佳菌种配比;通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和中心组合试验确定最佳培养基组成,在此优化条件下对接种量、发酵温度、发酵时间和装瓶量四个因素进行单因素试验和Box-Behnken 试验优化,以发酵产物的真蛋白和粗纤维作为考察指标,得到最优发酵工艺条件,为挤压酱油渣固态发酵制备蛋白质饲料提供试验依据。


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材料与方法


1.1 材料与试剂

酱油渣(原料为65%的豆粕和35%小麦,加入17%食盐经循环浇淋法制取酱油而得)由山东玉兔食品有限责任公司提供;黑曲霉3.324 和枯草芽孢杆菌由沂源康源生物科技有限公司提供;白地霉1315 和产朊假丝酵母1314购于中国工业微生物菌种保藏管理中心;试验所用试剂均为分析纯,购买于国药化学试剂有限公司。

1.2 常规培养基

黑曲霉3.324液体种子培养基采用改良马丁培养基;枯草芽孢杆菌液体种子培养基采用LB培养基;产朊假丝酵母1314和白地霉1315液体种子培养基采用YPD培养基。

1.3 主要仪器与设备

单螺杆挤压机,山东理工大学农产品精深加工与贮藏实验室自制;K9860 型全自动凯氏定氮仪,济南海能仪器股份有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 挤压酱油渣的制备

前期试验研究得出酱油渣最佳挤压条件为:挤压温度为103 ℃,水分含量为34%和螺杆转速为98 r/min。

1.4.2 真蛋白含量的测定

真蛋白含量的测定参考李佳瑶等[9]方法。

1.4.3 粗纤维含量的测定

粗纤维含量的测定参考Al-Sheraji等[10]方法。

2010年成功等[19]对特发性脊柱侧凸患者CT图像进行CT薄层分析、CT三维重建,建立起新分型,首先根据主侧凸所在的部位分为2型。然后根据侧凸的数量、侧凸顶点位置,侧方弯度矫形率以及其他三维畸形特点,分成不同的亚型,共分成14个亚型,并对每一分型制定了具体的融合策略。此新分型与king分型、Lenke分型相比,简单易记,逻辑严谨,与PUMC分型相比,因为借助CT三维重建模型,是一种三维评估分型系统,形象直观的反应了特发性脊柱侧凸三维畸形的特点。但是其分型依据只有80例,会导致数据不够,分型不全面,其次在手术矫形中所提出的入路、融合范围、具体的融合阶段只是雏形,未经过大量的临床检验。

1.4.4 发酵条件单因素试验

以黑曲霉∶枯草芽孢杆菌∶产朊假丝酵母∶白地霉=3∶2∶1∶3为混合菌种配比,发酵培养基组成为葡萄糖0.15 g、蔗糖0.15 g、尿素0.15 g、氯化铵0.27 g,料液比1∶1.4 和麸皮添加量3.45 g 为混菌发酵试验条件,选择种子液的接种量分别为5%、10%、15%、20%和25%;发酵温度分别为24、27、30、33 ℃和36 ℃;发酵时间分别为2、3、4、5 d和6 d;挤出酱油渣装瓶量分别为5、10、15、20 g和25 g,以真蛋白和粗纤维含量为指标,确定各因素的最佳发酵条件。

1.4.5 Box-Behnken试验设计优化发酵条件

根据单因素试验结果,选取最优的因素水平作为响应面的“零”水平,利用Design-Expert 软件中Box-Behnken进行试验设计,试验因素与水平见表1。


表1 响应面优化发酵条件试验因素与水平


1.5 数据统计与分析

利用Design-Expert 8.0.6软件进行数据处理和分析,包括回归分析、二次多项式回归方程、方差分析和响应面;利用Origin Pro 9.1软件进行绘图。所有试验重复3次。


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结果与分析


2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 接种量对发酵产物的影响(见图1)


图1 接种量对发酵产物的影响


未接种时,固态培养基中真蛋白含量和粗纤维含量分别为24.6%和30.5%。由图1可知,随着接种量从5%增加到15%时,真蛋白含量逐渐增大,但是粗纤维含量表现为逐渐递减的趋势,这是因为接种量过小会造成微生物增殖缓慢,延长生长周期,此时产朊假丝酵母和白地霉积累的菌体蛋白含量不高,同时黑曲霉分泌的纤维素酶含量较低,对粗纤维的降解并不明显[11];当接种量超过15%时,真蛋白含量逐渐降低,粗纤维含量则增加,这是因为固体发酵培养基中营养物质有限,造成微生物提前进入衰老期,产朊假丝酵母和白地霉发生自溶,同时枯草芽孢杆菌提前进入衰老期造成分泌的蛋白酶含量较低,物料中少量的蛋白分子被分解,没有足够的氮源供微生物生长,此外接种量的增大还会引起培养基中水分含量的变化,这也会对微生物的生长产生较大的影响[12]。故选择最佳接种量为15%。

2.1.2 发酵温度对发酵产物的影响(见图2)


图2 发酵温度对发酵产物的影响


由图2 可知,在发酵温度为33 ℃时,真蛋白含量达到最大值,此时粗纤维含量为最小值,这可能是温度偏低,菌体细胞内酶的催化活性变低,影响菌体细胞内物质的合成速度,不利于菌体蛋白的积累[13],同时黑曲霉分泌的纤维素酶活力较低,对纤维的降解能力变低[14];当发酵温度大于33 ℃时,真蛋白含量逐渐降低,粗纤维含量开始增加,这是因为发酵温度偏高,细胞会随着温度升高而细胞内酶蛋白活性被抑制甚至变性失活,导致蛋白质转化率下降,同时菌体也会快速衰老、自溶,导致蛋白质含量的降低,与此同时纤维素酶活力也会因为温度过高而降低甚至失活,导致粗纤维含量的增加[15]。故选择最佳发酵温度为33 ℃。

2.1.3 发酵时间对发酵产物的影响(见图3)


图3 发酵时间对发酵产物的影响


由图3 可知,随着发酵时间的增加,真蛋白含量急剧增加,粗纤维含量则表现为减少,当发酵时间为5 d时,真蛋白含量达到最大值,粗纤维含量则为最小值,这是因为产朊假丝酵母和白地霉充分利用固体培养基中的营养物质,快速生长繁殖,形成更多的菌体蛋白,同时黑曲霉和枯草芽孢杆菌分泌出大量的蛋白酶分解原料中的蛋白质,形成更多的氮源,供微生物生长繁殖,此外黑曲霉分泌的纤维素酶具有较高的活性,对挤压后酱油渣中的纤维产生分解,形成更多的单糖或寡糖,提供大量的碳源,为微生物繁殖提供必要条件[16-17];当发酵时间超过5 d时,培养基中的营养物质被消耗殆尽,菌体出现自溶现象,这说明真蛋白含量与微生物的生长情况有关系[4],同时大量处于衰老期的微生物代谢废物的堆积,导致菌体生长受到抑制并产生一些不必要的副产物,也会增加培养基质染菌的可能性[18],导致真蛋白含量的降低,此时由于黑曲霉分泌的纤维素酶较少,对挤压酱油渣中纤维的降解并不明显,与发酵5 d 并无显著差异[19]。故选择最佳发酵时间为5 d。

2.1.4 装瓶量对发酵产物的影响(见图4)


图4 装瓶量对发酵产物的影响


由图4中可知,当装瓶量为15 g(250 mL三角瓶)时,真蛋白含量达到最大值,粗纤维含量则为最小值,这是因为适宜的装料量有利于发酵过程中的氧气和热量的传递,进而促进微生物的生长代谢,提高纤维素的降解和菌体蛋白的生成[1];当装瓶量过少时,培养基中的营养物质不能满足微生物生长需要,减少菌体蛋白的积累,同时黑曲霉分泌的纤维素酶较少,对粗纤维降解效果不佳,导致真蛋白含量较低,粗纤维含量较高,当装瓶量过多时,培养基中溶氧量不足,微生物生长受到限制,同时还会造成培养基热量无法散失,微生物生长温度过高,导致菌体蛋白、酶等发生变性,引起真蛋白含量的降低和粗纤维含量的增加[20]。故选择最佳装瓶量为15 g。

2.2 Box-Behnken试验结果(见表2、表3)


表2 响应面优化发酵试验结果


以真蛋白含量和粗纤维含量为响应值,Box-Behnken试验安排与结果如表2所示,通过Design-Expert 软件对试验结果进行拟合分析,分别获得二次回归方程如下所示:

Y 真蛋白=31.37+0.38A+0.68B+0.52C-0.20D+0.010 AB+0.022AC+0.074AD+0.27BC-0.51BD+0.079CD-0.68A2-0.39B2-0.60C2-0.33D2

Y 粗纤维=17.59-0.12A-0.01B-0.49C+0.01D-0.028 AB-0.113AC-0.223AD-0.015BC+0.198BD+0.075CD-0.005A2-0.154B2+0.14C2-0.006D2

从回归模型方差分析表(表3)中可以得出,真蛋白含量和粗纤维含量回归方程模型P值均小于0.05,说明该回归模型差异显著,且失拟项P 值均大于0.05,不显著,说明回归模型是合理可行的;由R12=0.926 8,R12Adj=0.853 5,R22=0.823 4 和R22Adj=0.646 8 均大于0.6 可以看出,试验结果具有较高的可信度和精密度。从表3中可以看出A、B、C、BD、A2、B2和C2对真蛋白含量有极显著影响,D和D2对真蛋白含量有显著影响;C 对粗纤维含量有极显著影响;其他相对真蛋白含量和粗纤维含量没有显著性影响。所以综上所述,建立的发酵条件回归模型与真蛋白含量和粗纤维含量的数据相吻合,可以用来预测各因素对真蛋白含量和粗纤维含量的影响。


表3 回归模型方差分析

注:F1、P1、R1为真蛋白含量,F2、P2、R2为粗纤维含量。


由表3可以看出BD交互项对真蛋白含量有极显著影响,通过软件绘制响应面分析图,如图5 所示。从图5 中可以看出,保持装瓶量不变,真蛋白含量随着发酵温度的增大而增大,当发酵温度达到36 ℃左右时,真蛋白含量达到最大值,随后开始逐渐降低;当发酵温度不变时,真蛋白含量在10 g左右时达到最大值,之后随着装瓶量的增加而降低。


图5 发酵温度和装瓶量对真蛋白含量影响的响应面


通过Design-Expert 软件得出,对真蛋白含量和粗纤维含量发酵条件最优组合为:接种量16.6%,发酵温度36 ℃,发酵时间6 d 和装瓶量10 g,此时真蛋白含量和粗纤维含量的理论值分别达到最大值32.19%和最小值16.77%。在最优发酵条件下,进行3 次重复试验测得真蛋白含量和粗纤维含量平均值分别为32.11%和16.82%,并且粗蛋白含量为36.55%。实测值与预测值误差小于0.05%,说明试验数据与模型吻合良好。


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结论


试验研究混合菌种固态发酵挤压酱油渣制备蛋白质饲料,以真蛋白含量和粗纤维含量为考察指标,通过单因素试验和Box-Behnken 试验设计对发酵工艺进行优化,确定最佳发酵工艺为接种量16.6%,发酵温度36 ℃,发酵时间6 d和装瓶量10 g。在此优化条件下,挤压酱油渣发酵产物中真蛋白含量和粗纤维含量分别为32.11%和16.82%,与未发酵前相比,真蛋白含量提高了30.5%,粗纤维含量降低了44.8%,并且粗蛋白含量达到36.55%。本研究为挤压酱油渣制备蛋白饲料提供理论支撑,但是仍需要进行中试等研究,以更好地与实际生产相结合。


参考文献及更多内容详见:

饲料工业,2022,43(4):35-40



引用格式

张海静, 姜丽君, 张敏, 等. 多菌发酵挤压酱油渣生产蛋白饲料的工艺研究[J]. 饲料工业, 2022, 43(4):35-40.


转 载 声 明

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