《Cancer Cell》 IF48|血浆EV多组学揭示转移性前列腺癌mPC治疗期间的早期肿瘤适应性变化

研究背景

转移性前列腺癌（mPC）是一种致死性疾病；虽然新的系统疗法提高了mPC患者的生存率，但患者的应答在很大程度上是异质的，最终会产生耐药性。开发可以指导mPC临床决策的生物标志物是更精确的患者护理的关键。

在临床实践中获得用于分子分析的重复取样的、合适的肿瘤组织标本仍然具有挑战性。液体活检代表了一种新兴的分子表征和纵向疾病监测工具。循环肿瘤DNA（ctDNA）NGS测序已被证明对mPC的临床管理和治疗选择具有重要价值。相比之下，直接从临床血浆游离RNA（cfRNA）中检测肿瘤转录组特征大多不成功，因为RNA在没有细胞膜保护的情况下会迅速降解；由于与CTC分离相关的技术挑战，循环肿瘤细胞（CTC）的RNA分析尚未转化为常规临床实践。细胞外囊泡（EVs）是以脂质双分子层为特征的颗粒，肿瘤细胞产生的EVs在血浆中含量丰富，是癌症细胞通讯的关键介质，EVs的蛋白质货物成分在肿瘤进展、免疫调节和转移中发挥作用。然而，肿瘤EVs作为临床相关DNA和RNA生物标志物来源的潜力在很大程度上仍有待探索。

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研究结果

通过超速离心从23名转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）患者的回顾性队列的血浆样本中分离EVs，进行了三项表征。

酶消化实验证实，超过80%EV-DNA在这些囊泡内受到DNA酶保护，而cfDNA成分在DNA酶消化后完全降解，证实这是两个不同的生物实体。所有后续实验都包括DNA酶和蛋白酶K消化，以确保EV-DNA不含任何cfDNA。

分离各前列腺癌相关细胞系LNCaP、C4-2、22Rv1和PC3、22Rv1培养上清CCM EVs，并进行基本表征鉴定，以开发外泌体DNA NGS测序方法。EV-DNA的低深度全基因组测序（lpWGS，平均深度0.5X），显示EV肿瘤基因组具有代表性。方法：数据比对后去冗余，利用ReadCounter进行500Kb segmentation，采用ichorCNA分析拷贝数CNA和肿瘤分数TF。通过混合来自PC3条件培养基CM的EV-DNA和来自健康志愿者HV血浆的EV-DNA，进行spike-in实验：模拟1%至10%的肿瘤分数TF，来确定EV-DNA的ichorCN检测下限，发现IchorCNA能够准确地检测<10%的TF。

临床样本中大囊泡（12 Kg离心产物）和sEV（100 Kg及其衍生的碘克沙醇密度梯度组分）的DNA LpWGS，证实了这2种成分中整个肿瘤基因组的代表性，具有相似的CNA谱和TF。

接下来分别在雄激素受体信号抑制剂（ARSI）或紫杉烷治疗期间的不同时间点（基线，BL；治疗中，on-ttx；进展，PD）收集血浆，评估了来自两组35和18例去势抵抗性mCRPC病例的EV-DNA和cfDNA。在mPC患者样本中，EV-DNA的dsDNA大小分布与cfDNA不同：cfDNA富集了较小的DNA片段（100-200bp），而EV-DNA富集了较大的片段（>1000bp），mPC患者血浆中EV-DNA的浓度几乎比cfDNA低20倍。根据lpWGS计算的TF在EV-DNA和cfDNA之间相似。在28/51例EV-DNA和35/51例cfDNA治疗基线样本中发现TF≥4%，在基线时EV-DNA TF≥4%的患者中，50%的患者在治疗后仍保持TF≥4%，在系统性治疗应答的患者中on-ttx时间点TF显著降低。

EV-DNA中TF≥4%与肿瘤负荷的临床标志物有关，包括前列腺特异性抗原（PSA）、乳酸脱氢酶（LDH）、碱性磷酸酶（ALP）和骨转移。EV-DNA TF与患者预后相关：对于接受ARSI或紫杉烷类化疗的患者，基线EV-DNA TF≥4%与较短的进展时间显著相关；ctDNA也有类似的预后价值。

在可检测到TF且具有匹配的mPC肿瘤活检标本、血浆EV-DNA和cfDNA的患者中（22/51名患者），使用lpWGS检测CNA谱。EV-DNA具有全基因组CNA代表性，捕获了典型的mCRPC事件，如雄激素受体（AR）和8q扩增，8p、10和13号染色体缺失。EV-DNA和肿瘤组织活检（肿瘤DNA）之间的CNA谱高度相关。这些发现证实了循环EV中存在肿瘤DNA货物。

基于另外一种方法分离外泌体，进行基本表征。通过碘克沙醇密度梯度离心进一步分离sEV，证实了EV-RNA研究分离的sEV的纯度。用RNA酶处理预裂解的血浆EV，证实本方法大多数RNA包封于囊泡内受到保护。

方法开发：基于SmartSeq2方法改进，专门从这些小RNA分子中捕获蛋白质编码RNA，并制备用于评估循环EV中mRNA表达（RExCuE）的文库，并将其应用于与EV-DNA研究相同的两个mCRPC队列。对于EV RNA-seq分析，重点研究了EV-DNA lpWGS可检测到TF的病例，旨在优先考虑那些可能对循环中的整体EV池有较高相对贡献的肿瘤病例。在接受ARSI治疗（n=15名患者，38个样本）或紫杉烷类化疗（n=13名患者，33个样本）的mPC患者的血浆样本中检测了EV RNA-seq。EV RNA大小在50至200 nt之间显著富集，测序数据量平均为65M reads，平均比对率为53.6%。获得了30000多个基因的表达数据，基因的CPM表达量分布范围为0.9-24。

从ARSI队列（n=38）中用于EV-RNA分离的同一血液样本中分离的外周血单个核细胞（PBMC）（n=9）的RNA-seq被用作EV RNA-seq数据的对照，并将这些mPC病例的血浆EV-RNA转录组与年龄匹配的男性健康志愿者HV队列（n=7）进行了比较。

PCA分析：与mPC血浆EV-RNA与PBMC-RNA和HV-EV-RNA清晰分离。

差异基因和富集分析：EV-RNA和PBMC-RNA之间超过10000个基因显著差异表达，EV-RNA中PC相关转录物以及其他肿瘤相关途径富集，PBMC-RNA中富集的基因大多与血液谱系和免疫系统特征有关。ARSI队列中mPC患者（n=14个治疗基线样本）与HV的EV-RNA间>200个基因显著差异表达，mPC患者EV-RNA中高度上调的基因包括几个与角蛋白和其他肿瘤相关过程相关的基因，GO分析显示在组织发育、上皮发育和分化以及角质化等生物过程富集。

反卷积分析：了解不同细胞类型对HV与mPC患者循环EV中检测到的转录组信号的相对贡献。与肿瘤组织RNA（TBx RNA）相比，HV和mPC患者血浆EV-RNA中细胞类型的平均得分显示了血液相关细胞类型的富集。与HV相比，mPC患者的EV-RNA显示出更高的细胞类型富集，这些细胞类型通常富集于癌症中，如上皮细胞和角质形成细胞，支持了临床样本中部分EV的前列腺癌症起源。mPC EV-RNA中观察到的上皮细胞富集，与匹配的肿瘤活检RNA（TBx RNA）一致。

研究全基因组拷贝数变异CNA与RNA表达之间的相关性：1）在公开的SU2C/PCF队列中活检组织的RNAseq数据评估了这种相关性，确定了癌症中常见的扩增区域8号染色体上拷贝数和转录物水平之间的显著相关性。2）检查了ctDNA拷贝数改变与液体活检样本集中EV-RNA转录水平之间的关系，以及EV-DNA拷贝数改变和EV-RNA翻译水平之间的关联，并验证了8q区域的显著相关性。在mPC中常见缺失区域（如10q、13q和17q）观察到EV-DNA/EV-RNA的额外相关性。作为阴性对照，HV样本之间没有观察到相关性。3）确定了mCRPC中的驱动基因和常见扩增基因AR和MYC，EV-DNA拷贝数与EV-RNA表达的相关性。4）TP53突变（功能丧失突变和拷贝丢失）的患者EV-RNA中TP53转录物水平较低。5）EV-DNA中TF含量高（>25%）的样本中邻近基因的一致上调或下调，从EV-RNA表达谱中推断出拷贝数图谱，并将这一推断CNA谱与匹配的EV-DNA样本的lpWGS进行比较。EV RNA衍生的CNA谱概括了每个患者EV-DNA中观察到的大多数拷贝数变化。6）纵向收集的同一患者样本与不匹配患者样本之间EV-RNA的相似性：通过计算前列腺癌相关基因signature（Labrecque18和Tomlins19），以及先前发现在EVs与匹配PBMC中差异表达的那些非癌症、免疫相关的KEGG signature，用PCA分析中的欧几里得距离来量化相似性。同病例的EV-RNA样本之间的距离明显短于预期，血浆EV-RNA样本中存在PC相关转录物，其水平高于从用于EV-RNA分离的同一血液样本中分离的PBMC RNA。

为了研究EV-RNA作为纵向反应和耐药性生物标志物的潜力，研究了在PC模型中用ARSI恩杂鲁胺治疗后循环EV-RNA的变化，包括体外细胞系（LNCaP和C4-2）和体内模型（LNCaP和C4-2异种移植物）。使用RExCuE方法对体外肿瘤细胞（Cell RNA）、体内肿瘤样本RNA（TBx RNA）和从LNCaP和C4-2异种移植瘤小鼠血浆中分离的EV-RNA进行了RNA-seq研究。

LNCaP EV-RNA的基因集富集分析（GSEA）显示，恩杂鲁胺治疗后代谢相关基因（Hallmark mTORC1信号传导）和细胞增殖特征（Hallmark G2/M检查点）下调，AR信号传导相关特征减少，与基底样和神经内分泌（NE）分化相关的几个特征增加，与体外和体内LNCaP模型的观察结果一致。C4-2 EV-RNA中AR相关特征的表达有所减少，尽管幅度较小；这与C4-2模型中恩杂鲁胺敏感性较低是一致的。

患者来源的异种移植物（PDX）P886的血浆EV-RNA分析：PDX P886来源于1名转移性新发前列腺癌患者的前列腺活检，格里森评分为5+4，对雄激素剥夺疗法（ADT）有短暂的持续应答，在ADT 6个月后进展为去势抵抗。PDX P886被随机分为溶媒组或恩杂鲁胺组：与临床观察相似，PDX P886最初对恩杂鲁酰胺有应答（恩杂敏感期），治疗一个月后肿瘤迅速复发（恩杂难治期）。PDX P886表现出肿瘤内AR表达异质性，在恩杂鲁胺暴露后，AR阴性细胞富集。收集了恩杂鲁胺/溶媒治疗后第9天（恩扎敏感）和第29天（恩扎难治）的肿瘤（TBx RNA）和血浆（EV-RNA）。血浆EV-DNA的CNA谱与PDX肿瘤（TumDNA）的CNA图谱相匹配。与PDX肿瘤样本中观察到现象一致，治疗9或29天后，EV-RNA显示AR特征显著下调。有趣的是，与溶媒组相比，恩杂鲁胺治疗后第9天的血浆EV-RNA已经显示出与分化较差的mPC相关的特征（基底样和NE特征）的富集，而在匹配的肿瘤组织样本中，NE相关特征的富集仅在肿瘤宏观生长的后期时间点（29天）才变得明显。总之，EV-RNA-seq概括了匹配肿瘤对治疗反应的表达程序，可以检测与恩杂鲁胺耐药性相关的变化。

分析了ARSI和紫杉烷队列中用于EV-RNA-seq的纵向收集样本（治疗基线、治疗时和进展时）的基因表达，重点分析MSigDB hallmark基因集和一组与前列腺癌症相关的文献鉴定的基因signature。

在ARSI队列中，治疗4周后，EV-RNA显示与细胞增殖（E2F靶点、MYC靶点和mTORC1信号传导）和AR信号传导（管腔活性、AR-FL、AR-Labrecque和AR-V7）相关的几个Hallmark基因集持续下调。相反，与基线相比，暴露于ARSI后，EV-RNA中的基底样和神经内分泌相关基因集（RB1缺失、NE-Labrecque、NE+双阴性前列腺癌症（DNPC）、NE活性、CXCR2-NE和基底-Zhang）增加，符合已知的耐药性机制。

在紫杉烷患者队列中，治疗中的EV-RNA样本显示出明显的转录组演变，其特征是与PI3K/mTOR、MYC和凋亡途径相关的肿瘤增殖特征减少，这可能反映了化疗的作用机制。

与各自的治疗基线样本相比，观察到在ARSI和紫杉烷治疗进展时，管腔样基因减少，基底基因特征增加。

比较归类为ARSI和紫杉烷无反应者与反应者的患者的基线EV-RNA：ARSI无应答患者的基线EV-RNA富含与低分化PC相关的基因集，与应答者相比，与管腔活动、AR信号传导和DNA修复相关的基因组的代表性较低。这些发现在两个已发表的接受恩杂鲁胺治疗的mPC患者队列中得到了验证，这两个队列使用了可用的基线肿瘤活检RNA-seq数据和注释的临床结果数据。在ARSI队列中，基线EV-RNA神经内分泌活性较高的患者进展时间较短。

与应答者患者的基线样本相比，紫杉烷队列中无应答者的基线EV-RNA中与低分化肿瘤相关的基因集（NE活性、NE-Labrecque和Basal Zhang特征）被耗尽，但与较高增殖相关的特征（MYC靶点、P53、PI3K、mTORC、E2F等）被富集。紫杉烷无应答者的基线EV-RNA也显示出多西他赛耐药基因特征的显著富集。

综上所述，EV-RNA再现了循环中恩杂鲁胺抗性（AR低，干性）或紫杉烷抗性（高度增殖）肿瘤的转录特征。

在ARSI治疗开始时，EV-RNA对与AR信号相关的多种特征的下调在对治疗产生PSA反应的患者中被选择性地标记，而对治疗无应答的患者的转录组基本保持不变，这进一步表明EV-RNA可以在治疗期间捕获肿瘤转录组的变化。