本研究纳入了北京天坛医院的23名帕金森病患者和15名健康志愿者。对年龄和性别匹配的7 例 PD病例和 7例健康对照（表一）进行了二代测序 （NGS）。筛选了PD患者外周血外泌体中的circRNA，并与健康对照组相比，鉴定了PD 患者中差异表达的has-CD109_0002、has-SCMH1_0001和 has-ZNF652_0003作为差异表达的 circRNA（DEcircRNA）。对其余16例PD病例和8例健康对照的样本进行了实时PCR验证（表二）。该研究证明了has-SCMH1_0001的表达水平与运动障碍协会 （MDS） 发起的帕金森病统一评定量表第 III 部分 （MDS-UPDRS III） 的 PD患者评分一致。对竞争性内源性RNA（ceRNA）的分析揭示了受has-SCMH1_0001调控的关键基因，这些关键基因可能参与和PD相关的病理变化。
表一：二代测序研究参与者的人口统计学和临床特征。
表二：实时定量PCR研究参与者的人口统计学和临床特征。
采用TEM、NTA和蛋白质印迹分析对分离的外泌体进行表征。利用透射电镜观察外泌体的大小和杯状形态（图1A）。外泌体标志物TSG101、HSP70和CD9有富集，而钙粘蛋白在外泌体样品中不表达（图1B）。NTA追踪了1503个浓度为 2.2 × 1010/mL的颗粒，平均外泌体直径与TEM结果一致（图1C)。
图1：外泌体的鉴定。（A）通过透射电镜鉴定从血浆中提取的外泌体。放大倍率：×10,000。比例尺：200 nm。箭头表示外泌体。（B）TSG101、CD63和钙粘蛋白在外泌体和细胞裂解液中表达的蛋白质印迹分析。（C）NTA检测的粒径。
对7名PD患者和7名健康对照的血浆外泌体RNA进行测序，鉴定出9167 个已知circRNA 和 2875个新circRNA。与健康对照组相比，研究发现PD患者中有62个上调和37个下调的circRNA，以及先前报道的160个上调和377个下调的mRNA。对99 个DEcircRNA和537个DEmRNA进行分层聚类分析（图2A），火山图2B显示了差异表达的circRNA。差异表达的circRNA的染色体分布如图2C所示。并对DEcircRNAs的靶基因进行了GO、KEGG和COG注释和富集分析（图2 D、E）。
图2：环状RNA（circRNA）的表达和差异表达circRNA（DEcircRNAs）的功能注释。（A） 帕金森病 （PD） 患者与健康对照组差异表达的 circRNA分层聚类。表达值以色标表示。强度从蓝色（相对较低的表达）增加到黄色（相对较高的表达）。不同的列代表不同的样本 （n = 14），每行代表一个circRNA。（B）PD 患者与 健康对照组的 circRNA的火山图。每个点代表一个circRNA。垂直虚线对应于1.5倍的上调和下调（log2转化），水平虚线表示p 值0.05。红点表示表达相对较高，绿点表示表达相对较低，黑点表示非差异表达基因。（C）染色体中DEcircRNA的分布。外环是参考基因组的染色体。条形图表示每个位置的circRNA数量，热图表示每个样品的表达。（D）DEcircRNAs来源基因的GO分类。横坐标为GO分类，左坐标为来源基因数的百分比，右坐标为基因数。（E）DEcircRNAs来源基因的直系同源组（COG）功能分类簇。横坐标为COG分类内容，坐标为来源基因数。
基于PD组与健康对照组的差异表达水平以及鉴定基因的功能注释，研究人员选择了has-CD109_0002、has-SCMH1_0001和has-ZNF652_0003进行后续研究。qPCR分析显示，PD患者与健康对照者在has-CD109_0002和has-ZNF652_0003表达水平方面没有显著差异。has-SCMH1_0001表达水平显著下调（p < 0.05），与NGS数据一致（图3A).
图3：通过qPCR确定CircRNA表达和临床相关性分析。GAPDH被用作管家基因。（A）两组has-CD109_0002和has-ZNF652_0003表达无显著差异。在帕金森病患者中，has-SCMH1_0001下调。（B）has-SCMH1_0001表达与MDS-UPDRS III评分呈负相关。has-SCMH1_0001表达水平与MoCA评分之间没有相关性。
对两种经验证的circRNA的表达水平与PD患者的临床特征（包括MDS-UPDRS III评分和蒙特利尔认知评估（MoCA））进行相关性分析。MDS-UPDRS是PD评估的金标准，而MoCA是一种全球认知评估工具，用于检测PD中的轻度认知障碍（MCI）或痴呆。相关性分析表明，has-SCMH1_0001表达水平与MDS-UPDRS III评分呈负相关，因此运动症状较严重的患者表达的has-SCMH1_0001水平较低。表达水平与MoCA评分之间没有相关性。此外，has-CD109_0002和has-ZNF652_0003与这些分数均无显著相关性（图3B）。
基于预测的结合miRNA伴侣和下游靶基因，使用has-SCMH1_0001作为关键circRNA生成了ceRNA网络（图4)。通过CircInteractome 预测了17 个有可能与has-SCMH1_0001 结合的miRNA。miRNA通过抑制 mRNA翻译或导致 mRNA降解来发挥作用。使用TargetScanHuman、miRDB和 miRTarBase，总共确定了149 个潜在的靶基因。其中靶基因ARID1A 和C1orf115 也属于测序获得的DEmRNA。
图4：以has-SCMH1_0001为中心的ceRNA网络。使用CircInteractome预测circRNA和miRNA的结合位点。使用TargetScanHuman、miRDB和miRTarBase预测miRNA的靶基因。椭圆：circRNA，三角形：miRNA，圆角矩形：mRNA。红色圈出的mRNA 是DEmRNA。
与健康对照组相比，通过测序筛选出PD患者中62个上调和37个下调circRNA。相关性分析表明，has‐SCMH1_0001具有很强的临床相关性。该研究鉴定了17 个has-SCMH1_0001潜在结合 miRNA，这些miRNA具有149个潜在靶基因。ARID1A和C1orf115属于预测靶基因与测序得到的差异表达mRNA的交集。本研究表明，has‐SCMH1_0001及其靶基因ARID1A和C1orf115在PD患者中下调，可能与PD的发生有关。
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