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免疫检查点抑制剂已广泛应用于多种实体肿瘤，尤其是对于非小细胞肺癌，大幅提升了部分患者的5年生存率，重新定义了一线治疗标准，增加了把肿瘤变成慢性病的可行性。然而，在精准医疗时代，基于组织学标本的PDL1表达实用性屡受挑战，t-TMB或b-TMB的检测平台与判断标准争议较大，MSI-H/dMMR阳性率与适用瘤种过于狭隘，均无法满足免疫治疗疗效预测、不良反应预警、耐药机制解读等临床需求。近年来，联合标志物的筛选与组合，成为解决上述问题的研究热点。研究者发现细胞外囊泡（ EVs ）是细胞衍生的纳米级囊泡（ 约 1 0 0 n m ），在免疫过程中发挥着重要作用 ，而EVs 携的 带 数 千 种 RNA 和 蛋 白 质 ， 使其成为标志物联合分析的理想候选。并且因为外周血标本获取的无创、实时、动态，其安全性与可行性更易被医生与患者接受。传统的EV RNA和蛋白质分析方法通常需要两种独立的技术，例如用于RNA分析的qPCR和用于蛋白质检测的酶联免疫吸附试验（ELISA）。然而，采用两种方法分别进行检测，面临着样本需求增加和分析复杂性加倍的问题。北京大学国际医院汤传昊团队，北京航空航天大学常凌乾课题组，与军事医学科学院生物工程研究所徐小洁副研究员和北京大学肿瘤医院吴楠主任合作，开发了一种高通量的微液滴增强芯片系统（图1）。该系统能够同时检测细胞外囊泡（EVs）中的5种RNA、5种膜蛋白和两种作为内参的标志物。通过微室阵列的浓度富集作用，该系统无需进一步放大，就能检测到aM级别的RNA和fM级别的膜蛋白。通过分析30位非小细胞肺癌患者的10个与免疫疗法相关的标记物，该团队发现综合蛋白质和mRNA标志物的模型（AUC
0.911）的预测性能显著优于单一标记物（AUC
0.831）。
相关成果以“Microdroplet-enhanced
chip platform for high-throughput immunotherapy marker screening from
extracellular vesicle RNAs and membrane proteins”为题，发表在《Biosensors
and Bioelectronics》上。![]()
该系统通过使用12个独立的微室阵列作为微液滴的替代品，保留了浓度增强的效果，同时消除了微液滴检测不稳定的缺点。另外，核酸适体被用来特异性识别EVs膜蛋白，从而可以将膜蛋白的表达水平转化为核酸适体的浓度。微室阵列中预装了Cas12a系统来检测核酸适体，Cas13a系统则用于检测EVs
RNA序列，从而实现细胞外囊泡膜蛋白与RNA的同时高通量检测。![]()
利用微室阵列对样本进行体积分割，样本内的标志物浓度可以得到明显提升，从而显著提高检测的灵敏度。终点荧光图像显示，随着目标序列浓度的增加，发出荧光的微室数量逐渐增加。Cas13a系统在10
aM至10
fM的目标浓度范围内，以及Cas12a系统在10
fM至10
pM范围内，均能得到良好的线性拟合。同时，这说明RNA序列的检测限（LOD）达到10
aM，DNA的检测限达到了10
fM。与在溶液中检测到的LOD相比，两者都提高了100倍（Cas13a，1
fM；Cas12a，1
pM）。
为了评估系统在高通量筛选EVs标记物方面的性能，该团队分析了30位接受免疫疗法前的非小细胞肺癌患者的血浆样本。为了测试预测价值，所有样本根据患者的治疗结果被分为高响应组（n=15）和低响应组（n=15）。与单一生物标记物相比，结合多个生物标记物进行检测产生了协同效应，并展现出更好的治疗效果预测。尤其是，当将RNA和蛋白质生物标记物都纳入模型时，生物标记物组合的性能得到了进一步增强。最终，五个标记物的组合，IDO1、S100A8、has-miR-223-3p、CEA和PD-L1，显示出最高的AUC
0.911（敏感性，93.3%；特异性，80%）。这进一步表明，同时检测EVs
RNA和蛋白质标记物可以从不同方面获取信息，从而以更高的准确性预测患者免疫治疗的疗效。
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图3.临床患者样本检测结果显示，细胞外囊泡联合标志物显示出更高的预测准确度。
该工作的通讯作者为军事医学科学院生物工程研究所徐小洁研究员、北京航空航天大学常凌乾教授和董再再助理教授，以及北京大学肿瘤医院吴楠副院长。第一作者为北京大学国际医院汤传昊副院长，共同第一作者为北京大学肿瘤医院阎石主任医师。
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566324007541
![]( "矩阵图(1).jpg")
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