摘要：小麦是全球主要作物，为人类饮食提供约 20% 的蛋白质和热量。然而，由于病虫害和非生物胁迫，小麦的产量潜力受到限制。尽管传统育种已改善了一些理想性状，但与玉米、大豆等其他作物相比，现代转基因技术在小麦中的应用受到限制。小麦基因克隆和转化技术的最新进展，如今使得培育符合可持续性、粮食安全和环境管理等 “同一健康” 目标的超级小麦成为可能。该品种结合了增强病虫害抗性、提高谷物营养价值以及提高对气候变化的适应能力等特性。在本综述中，作者探讨了利用现有技术将有用性状组合并转化到小麦中的方法。作者还涉及了育种者的需求以及专利和监管等法律方面的考虑因素。
关键词：小麦、普通小麦（Triticum aestivum）、抗病性、抗逆性、基因修饰、转基因作物
1. 引言
至少在 14400 年前，约旦地区就有人采集野生小麦祖先的麦粒并将其加工成烘焙食品，而小麦在 4000 年后于新月沃地被驯化。这使得农民能够掌控粮食生产，进而催生了定居型社会，开启了文明的发展进程。如今，普通小麦（Triticum aestivum）是地球上种植最为广泛的作物，它与全球的历史、文化、宗教以及政治等诸多方面紧密交织在一起。目前，小麦年产量超过 7.5 亿吨，为全球提供了五分之一的热量和蛋白质摄入。大约有 2.8 亿吨小麦谷物通过国际边境出口到 90 多个国家，价值达 585 亿美元。阿根廷、澳大利亚、保加利亚、加拿大、法国、印度、罗马尼亚、俄罗斯、乌克兰和美国这十个国家掌控着四分之三的小麦贸易量，这凸显了小麦与政治以及全球经济之间的相互关联。
小麦的生产和消费面临着诸多可持续性及健康方面的挑战。传统的小麦种植通常需要大量耗能的化肥和农药。尽管大量施用农药，但由于病虫害的影响，预计每年小麦产量仍会减少约 21%（2 亿吨）。由于这种产量损失通常发生在作物生长季的后期，也就是在施用农用化学品之后，这意味着巨大的能源浪费，估计达 4200 亿千瓦时，相当于 120 艘装满原油的油轮所蕴含的能量。
非生物胁迫也严重限制了小麦的种植，其中水分亏缺被视为最为关键的因素之一。在许多地区，小麦依靠从地下蓄水层中不可持续地抽取水源进行灌溉，而在非灌溉的干旱环境中，降雨的不规律限制了小麦产量。尽管小麦在人类饮食中十分重要，但它可能缺乏某些微量营养素，比如铁和锌，并且会使易感人群患上乳糜泻。小麦生产、消费以及粮食安全方面面临的这些挑战与 “同一健康” 概念相契合，该概念倡导采用一种全面且可持续的方式来保障人类福祉以及维护环境。
众多生物技术工具为应对 “同一健康” 理念下小麦生产所面临的挑战提供了潜在途径。尽管长期以来围绕转基因（GM）小麦存在着诸多社会政治方面的阻碍，但阿根廷近期批准了耐旱的 HB4 小麦品种，这彰显了商业化转基因小麦的潜力。在本综述中，作者将探讨打造一种 “同一健康” 超级小麦所涉及的技术挑战，这种超级小麦需将诸如 HB4 耐旱性这类非生物抗逆性状与抗病性以及营养品质提升等性状相结合。作者还会审视限制克隆小麦抗病（R）基因使用的、有时颇为棘手的专利状况，以及这一状况如何既对构建持久抗性构成潜在挑战，又带来相应机遇。此外，作者也会探索一些方法，通过这些方法可以将符合 “同一健康” 目标的多个显性性状整合到小麦基因组的一个位点上，以便在育种计划中促进它们的共同遗传。
2. 构建生物抗性可提高小麦产量
植物所面临的生物胁迫是由种类繁多的生物造成的，这些生物包括真菌、细菌、病毒、类病毒、昆虫、线虫、蛛形纲动物以及杂草。这些生物会破坏寄主组织并剥夺植物生长必需的营养物质，进而导致植物活力下降甚至死亡。在农业领域，生物胁迫在作物收获前和收获后的损失方面都起着重要作用。在已记录的近 200 种病虫害中，有 50 种由于其对农作物造成损害以及影响农民收入的潜在可能性，被认为具有重要的经济影响。如前文所述，全世界预计的小麦产量中约有 21% 因病虫害而损失。
众多真菌病害会影响小麦并造成具有重要经济影响的损失，包括条锈病、叶锈病、秆锈病、白粉病、赤霉病（FHB）、褐斑病、冠腐病和根腐病以及小麦麦瘟病。将真菌病害导致的产量损失降至最低的两种主要途径是施用内吸性杀菌剂以及培育抗病品种。施用杀菌剂可能会引发显著的负面次生效应，例如促使抗药性病原体出现、有益的土壤菌根真菌数量减少以及对人类健康产生不利影响。使用具有遗传抗性的品种是最可持续的解决方案，但正如作者下文将要讨论的那样，这需要叠加抗病（R）基因，以应对病原体克服单个小种特异性 R 基因的能力。
限制小麦产量的主要害虫有蚜虫、麦二叉蚜和叶蝉。其中，俄罗斯麦蚜和禾谷缢管蚜最为重要，在严重发生虫害时，它们可导致高达 40% 的产量损失。此外，蚜虫还是致病性病毒的重要传播媒介。植物针对害虫的防御可分为三类：（a）由能将损害降至最低的遗传因素所介导的耐受性；（b）抗生性，即一种通过形态或化学机制阻止害虫取食的机制；（c）抗虫性，它会干扰害虫的健康状况和繁殖能力。
对小麦作物免受虫害的保护主要是通过杀虫剂和抗病品种相结合的方式来实现的。在一些作物中，转基因技术已经彻底改变了害虫防治方式，例如培育出了能产生苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的杀虫蛋白 Bt 的转基因品种。全球 Bt 作物的种植面积从 1996 年的 110 万公顷显著扩大到了 2019 年的 1090 万公顷。然而，与含有单个 R 基因的品种一样，Bt 抗性依赖于单个基因的表达。这会施加较高的选择压力，从而促使 Bt 抗性害虫出现，其数量从 2005 年的 5 例增加到了 2020 年的 26 例。
2.1. 基因组学进展推动了 R 基因克隆
R 基因是一种天然或诱导产生的遗传元件，能够赋予植物对害虫或病原体可检测的抗性。在普通小麦中已经鉴定出超过 467 个 R 基因，其中 42% 是从普通小麦基因库之外导入的。在已被克隆的 450 多个植物 R 基因中，绝大多数编码细胞表面免疫受体（占 17%）或核苷酸结合富含亮氨酸重复序列（NLR）类的细胞内免疫受体（占 55%）。这些蛋白质能够直接或间接识别病原体分子的存在，并发生构象变化以启动防御反应。
R 基因的克隆通常始于通过对遗传杂交进行性状分析来检测该基因。利用特征明确的遗传标记将基因的位置定位到抗性亲本的物理序列上，然后通过注释和基因表达研究对该序列仔细筛选候选基因。最后，通过敲除（例如，使用甲基磺酸乙酯（EMS）等化学诱变剂或 CRISPR - Cas9 等基因编辑工具）或敲低基因表达（例如，通过病毒诱导的基因沉默）的方式对候选 R 基因进行功能测试。理想情况下，还需在感病背景下进行瞬时或稳定表达，以确定该基因除了是抗性所必需的之外，是否足以产生抗性。
多年来，小麦 R 基因的分离受到小麦基因组复杂性的阻碍，小麦的六倍体基因组（2n = 6x = 42）不仅庞大（16Gb），而且包含大量重复序列（占 85%）。在许多定位克隆项目中，天然染色质与引入染色质之间受抑制的重组更是使情况变得复杂。因此，曾经克隆一个小麦 R 基因被视为一项艰巨的任务，需要耗费多年时间并投入大量资源。首个被克隆的小麦 R 基因是 2003 年的 Lr21，大约在从玉米（Zea mays；1992 年的 Hm1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana；1994 年的 Rps2）和番茄（Solanum lycopersicum；1994 年的 Cf - 9）中分离出首批 R 基因的十年后。
在随后的几年里，额外的小麦 R 基因克隆工作起初进展缓慢，但高通量 DNA 测序、生物信息学的改进以及降低基因组复杂性的技术共同加速了这一进程。例如，R 基因富集测序（RenSeq），即对 NLR 基因库进行外显子组捕获和测序，被应用于多个由 EMS 诱变产生的突变体（MutRenSeq），从而实现了对赋予小麦秆锈病抗性的 Sr22 和 Sr45 这两个 R 基因的快速克隆。此后不久，桑切斯 - 马丁（Sánchez - Martín）及其同事用染色体流式分选和测序（MutChromSeq）取代了 RenSeq，使得能够不受重组限制、无偏向性地克隆任何小麦基因，仅需一系列等位基因突变体即可。利用这些基因组学技术，截至目前，已实现了至少 14 个小麦 R 基因的克隆。
最近，DNA 测序成本的持续降低促进了基于关联遗传学的 R 基因快速克隆，该方法依靠 RenSeq 以及对包含数百份小麦及其野生近缘种的大型、遗传多样性群体进行全基因组鸟枪法测序。在 2019 年和 2022 年，利用这种方法从粗山羊草（Aegilops tauschii，一种作为小麦 D 基因组来源的野生草本植物）中克隆出了 Sr46、SrTA1662（Sr66）秆锈病抗性基因以及 WTK4 白粉病抗性基因。在 2023 年，同样的方法被用于从二倍体小麦近缘种高大山羊草（Aegilops longissima）中克隆出 Lr/Yr548 叶锈病和条锈病双抗性基因，从小麦中克隆出限制小麦瘟病菌寄主范围的 Rwt3 和 Rwt4 基因、小麦瘟病抗性基因 Rmg8以及小麦叶枯病（Septoria tritici blotch）抗性基因 Stb15。
测序及全基因组组装方面的改进，连同 Illumina 短读长、PacBio 以及牛津纳米孔技术（ONT）长读长测序技术，已被用于从小麦及其若干野生近缘种中生成携带目标 R 基因的参考样本。这有助于从沙融山羊草（Aegilops sharonensis）中克隆出 Sr62 秆锈病抗性基因、从小麦中克隆出 Yr27 条锈病抗性基因以及从二粒小麦（Triticum dicoccoides）中克隆出 Pm69 白粉病抗性基因。这些先进的测序技术也被用于生成小麦和粗山羊草的泛基因组，有助于从小麦中分离出抗麦红吸浆虫（orange wheat blossom midge）的 Sm1 基因以及从粗山羊草中分离出抗叶锈病的 Lr39 基因。
最近， Brabham及其同事构建了一个包含 995 个 NLR 基因的文库，这些 NLR 基因稳定转化到了小麦中。这些 NLR 基因是基于其抗性特征和 NLR 基因表达情况从 18 种小麦野生近缘种中分离出来的。通过这种方法，他们成功鉴定出了 4 个在田间提供秆锈病抗性的基因。在过去十年里，测序和功能基因组学技术的重大改进显著加速了小麦 R 基因的克隆工作，截至目前，已有超过 70 个 R 基因被分离出来。这些改进将有助于把 R 基因引入到优良小麦品种中。
2.2. 基因叠加可使小麦获得持久的生物抗性
单个 R 基因会对病原体施加较高的选择压力，这有利于产生能突破抗性的小种，最终使该 R 基因失效。出于这个原因，重点一直放在引入多基因叠加组合上。例如， Luo等人利用载体构建方面的进展以及已克隆的秆锈病（Sr）R 基因的可获取性，将 5 个 Sr 基因叠加导入易感染锈病的普通小麦栽培品种 Fielder中，使其对 7 种锈病小种产生了广谱免疫。这样的多基因叠加组合应该更具持久性，因为病原体难以产生能同时克服叠加组合中所有基因的变异体。随着叠加的基因数量增多，病原体克服抗性就变得越发困难。此外，叠加组合能使多个基因在世代传递过程中始终保持在一起，避免了意外的分离情况，而且在单个位点上存在叠加基因使得它们在育种计划中能更简便地在不同品种间转移（图 1）。
图1. 转基因与常规育种的抗病基因叠加对比
尽管针对小麦的主要病害已经克隆出了许多 R 基因，例如，有 19 个 Sr 基因、10 个条锈病（Yr）基因、13 个叶锈病（Lr）基因以及 20 个白粉病（Pm）基因，但对于其中的大部分（62 个中的 55 个）而言，其有效性要么较差，要么尚无相关记录，这阻碍了有效的基因叠加工作。基因的有效性可以通过将单个基因转入感病背景中，然后利用全球收集的病原体分离小种对所得的转基因植株进行检测来评估。与此同时，已克隆的 Sr、Yr 和 Lr 基因现有的部分有效性信息可用于设计初步的基因叠加组合，以构建针对秆锈病、条锈病和叶锈病的持久抗性。相比之下，已克隆的 Pm 基因通常有效性较差，要构建一个具有持久白粉病抗性的基因叠加组合，最多只能算是一种碰运气的做法。
基因叠加面临的另一个挑战是部分抗性性状具有数量性状的特点。例如，小麦赤霉病（FHB）抗性受到多个具有微小到中等效应的基因影响。截至目前，已经描述了 7 个小麦赤霉病抗性基因：源自小麦的 Fhb1、Fhb2、Fhb4 和 Fhb5，以及来源于其野生近缘种的 Fhb3、Fhb6 和 Fhb7。然而，只有 Fhb1和 Fhb7已被克隆，并且对于 Fhb1 的真实身份还存在疑问。对于稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae，即小麦瘟病菌）而言，小麦基因库中可用的抗性资源有限，迄今仅鉴定出 11 个 R 基因。目前，只有编码丝氨酸 - 苏氨酸激酶 MCTP（含多个 C2 结构域和跨膜区域蛋白）的 Rmg8 基因已被克隆。对于赤霉病和小麦麦瘟病来说，都需要更多已克隆的基因来构建基因叠加组合。
对昆虫的抗性往往是数量性状，因此在构建基因叠加组合时会存在问题。然而，通过将具有不同作用模式的 Bt 变体与针对害虫的显性抗生性基因（如针对麦二叉蚜的 H16 和 H17 基因、针对麦红吸浆虫的 Sm1 基因以及针对俄罗斯麦蚜的 Dn7 基因）进行聚合，可以在小麦中实现对害虫有效且持久的抗性。
检测多基因叠加组合的功能面临着重大挑战，因为多个 R 基因之间的上位性作用会阻碍在害虫或病原体病害检测中对单个基因有效性的确认。要克服这一困难，需要克隆出叠加组合中每个 R 基因所识别的相应害虫或病原体效应子。克隆的效应子可以通过异源表达检测（例如利用病毒）或者原生质体瞬时检测等方法逐个进行导入检测。效应子克隆工作落后于 R 基因克隆，这可能是由于许多小麦病原体具有专性活体营养型的特点。不过， Arndell及其同事最近建立了一个高通量的小麦原生质体系统，用于筛选来自小麦秆锈病菌（Puccinia graminis f. sp. tritici）的候选效应子文库，并迅速克隆出了 AvrSr13 和 AvrSr22 基因。这一令人振奋的方法为系统克隆小麦 R 基因所识别的所有效应子、为小麦主要病害提供抗性带来了很大的希望。
3. 构建非生物抗逆性以应对负面环境影响
全球小麦产量因干旱、极端温度、盐碱、氧化胁迫、养分缺乏以及土壤毒性等非生物胁迫而降低。在过去几十年里，这些胁迫的强度和发生频率持续增加，对植物生长、产量以及籽粒品质产生了负面影响。基因工程已提高了玉米、棉花和大豆的抗逆性，但在培育抗逆性转基因小麦品种方面进展有限。尽管有几项研究已成功培育出显示出抗逆性增强的小麦品种，但在实验室中观察到的抗性性状并不总是能在田间条件下表现出来。例如，在小麦中过量表达拟南芥转录因子 AtDREB1A，虽然在实验室中提高了干旱存活率，但在田间试验中却未见成效。此外，非生物胁迫抗性的增强往往伴随着生长和产量的下降，一些涉及小麦转录因子过量表达的研究也报道了这一情况。
对转基因介导的小麦抗逆性状进行田间评估的情况仍然较少，部分原因是一些地区需要严格的生物安全措施。因此，只有少数技术经过了田间试验验证。一个例子是 IND - ØØ412 - 7 小麦品系，它经过基因工程改造后具有更强的耐旱性。水分亏缺是包括小麦在内的许多农作物面临的最具破坏性的胁迫之一，所以在不影响产量的情况下增强耐旱性是一项备受期待的性状。在阿根廷 37 个田间试验点的田间试验中，携带来自向日葵（Helianthus annuus）的 HaHB4 转录因子的 IND - ØØ412 - 7 小麦品系，相较于野生型，其水分利用效率（单位降雨量所产生的产量）提高了 9%，产量提高了 6%。当仅考虑那些受水分亏缺限制的环境时，IND - ØØ412 - 7 在相对水分利用效率方面（提高 14%）和产量方面（提高 16%）展现出了更大幅度的增长。值得注意的是，在不存在水分亏缺的情况下，并未观察到产量损失（图 2）。这项技术已在南美洲进入商业化阶段，2022 年在阿根廷有 5 个被命名为 HB4 小麦的品种完成注册。
图2. HB4 小麦在实验室和田间条件下赋予小麦的耐旱性
在另一项耐旱性研究中，利用 430 份小麦材料进行全基因组关联分析，发现转录因子 TaNAC071 - A 的表达与严重干旱后的存活率之间存在强相关性。在水分有限条件下进行的一次包含三次重复的田间试验中，对过量表达 TaNAC071 - A 的株系进行测试，结果显示其抗逆性显著提高，与 CRISPR 敲除株系、RNA 干扰（RNAi）敲低株系或野生型株系相比，其穗长、穗宽、籽粒长度、籽粒宽度以及产量均有所增加。通过表达来自大肠杆菌（Escherichia coli）的修饰冷休克基因 SeCspA，以及在成熟和水分亏缺或开花和衰老期间特异性激活的启动子调控下过量表达细胞分裂素生物合成基因 IPT，也实现了干旱条件下田间产量的增加。
土壤中大量元素磷和氮的缺乏以及有毒化合物的存在往往会限制产量，因此它们是生物技术干预的重要目标。在谷子（Setaria italica）中，SiATG8a 是一种参与自噬信号传导的类泛素蛋白，被确定为在低磷条件下提高籽粒产量的潜在候选基因。对转 SiATG8a 基因小麦进行的田间试验显示，在标准条件下产量提高了 0.06 - 11.8%，在低磷条件下产量提高了 4.37 - 23.5%。大多数植物（包括小麦）无法直接利用分子态的二氮，而豆科植物可以通过其根部含固氮菌的根瘤获取这种氮。由多个机构组成的 “农业中实现营养共生” 联盟旨在将这种共生能力引入包括小麦在内的谷类作物中。
4. 通过改造小麦有益营养性状可提升人类健康
小麦的转基因改良可不仅仅局限于增强其对生物和非生物胁迫的抵抗力。小麦含有多种重要营养成分：碳水化合物（75% - 80%）、蛋白质（9% - 18%）、膳食纤维以及诸如维生素、钙、铁和锌等微量营养素。然而，小麦也缺乏足量的几种对人类健康至关重要的营养素，包括维生素 A、维生素 B12、维生素 C、大部分脂肪、若干微量营养素以及必需氨基酸赖氨酸。必需维生素和矿物质摄入不足会危及人类健康和发展，世界卫生组织指出，全球约有 20 亿人存在营养素缺乏问题，南亚和撒哈拉以南非洲地区受影响尤为严重。
由于大量人群存在铁和锌膳食缺乏的情况，铁和锌受到了极大关注。通过育种来提高籽粒中铁和锌的含量较为复杂，因为像土壤成分这类环境因素会对这些营养素的含量产生重大影响。另一个重要考量因素是矿物质的生物利用率。例如，小麦籽粒中的植酸会与钾、镁、锰、铁、钙和锌等矿物质结合，降低它们在消化道中的吸收。降低籽粒中植酸的含量或增强植酸酶的活性，能够提高这些矿物质的生物利用率。在小麦中表达一种热稳定的微生物植酸酶基因变体，使内源性植酸酶活性提高了 5 - 6 倍，并且在面粉经过热处理后仍保留了部分活性。在另一项研究中，通过转基因表达水稻基因 OsNAS2（该基因编码一种能产生氨基酸 —— 烟酰胺的酶，烟酰胺是一种锌和铁的螯合剂），使小麦籽粒中的锌和铁含量提高了 2 - 4 倍。
关于小麦的另一个重要膳食考量因素是其较高的麸质含量，麸质会使具有麸质不耐受遗传易感性的个体患上乳糜泻。基因工程已被用于消除、下调或去除小麦中如 α- 麦胶蛋白等麸质蛋白的毒性，旨在培育出能减少对麸质敏感个体产生负面影响的品种。当通过 RNA 干扰（RNAi）技术下调转基因株系中的 α- 麦胶蛋白基因时，α- 麦胶蛋白的含量降低了 60% 以上。利用 RNAi 下调目标基因，能够以显性的方式针对原本为隐性的性状进行操作，并且有可能将其纳入基因叠加组合中。
近期关于遗传力的研究表明，不同小麦品种在各种维生素及其他营养素含量方面存在遗传多样性，这为培育更具营养的小麦品种提供了宝贵的原材料。小麦参考基因组序列的公布、蛋白质组学和代谢组学的进步以及转基因技术的应用，为加速培育改良品种、提升小麦营养价值和健康效益带来了令人振奋的机遇。
5. 超级小麦工程技术可实现 “同一健康” 目标
基因转化能够将所需基因定向整合到宿主基因组中，从而加速育种工作，并克服有性不亲和的自然障碍。小麦遗传技术的最新进展为打造超级小麦开辟了广阔途径。然而，这些工作必须精心规划，要将体外构建基因叠加组合以及高效转化整合为一种协同策略，以最大程度减少单个转基因的分离情况，并便于后续的育种工作（图 3）。
图3.确保转基因事件共分离的转化策略
体外构建基因叠加组合有多种方法，每种方法各有优缺点。最常用的系统有 Gateway、Gibson 和 Golden Gate。Gateway 克隆已展现出极高的效率。然而，一个显著的局限在于它主要是二元性质的，涉及将单个插入片段转移到新的序列环境中。这一局限通过开发多插入位点的 Gateway 系统（如 Multisite Gateway Pro）得到了部分克服，该系统能够将多达四个 DNA 片段组合到一个目标质粒中。Gibson 组装技术通过在单管反应中无缝连接具有相同的 20 - 30 个碱基对末端的线性 DNA 片段，克服了上述局限。因此，与 Gateway 系统中的重组位点不同，其融合位点不存在任何非天然序列。而且，Gibson 组装具备组装长达数百千碱基序列的能力。不过，由于在组合的序列片段中需要使用相同的末端，这就限制了 DNA 模块的重复和多样化再利用。
基于 Golden Gate 克隆的分层 DNA 组装策略应运而生，以应对这一挑战。与此同时，植物研究领域内出现了三个备受青睐且被广泛采用的标准 ——GreenGate、GoldenBraid和模块化克隆（Modular Cloning）。这些系统都依赖于由 II 型限制性内切酶产生的标准化的 4 个碱基对的突出末端。这些突出末端可作为转录构建模块（包括启动子、编码序列和终止子）之间的融合位点。在对这些构建模块进行初始克隆后，所创建的模块会被组装成转录单元。对于更复杂的构建体，可以通过另一轮 Golden Gate 反应来组装多个基因。该系统为基因叠加提供了看似无穷的潜力，其唯一的限制在于受体载体的大小。然而，基于 Golden Gate 的 DNA 组装受限于需要从克隆序列中去除 II 型限制性内切酶识别位点。尽管这些内部识别位点在蛋白质编码序列中可能不成问题，但对于像启动子这类非编码序列而言，它们存在所带来的影响往往是不可预测的。
直到最近，唯一高效的小麦转化技术是由钟渊化学（Kaneka，前身为日本烟草公司）申请专利的，再加上需要昂贵的专业培训、授权以及特定载体，这构成了很高的准入门槛，使得该技术仅局限于少数公立和私立机构使用。不过，最近开发出了一种开源的、可高效进行农杆菌介导转化的替代方法。在使用该技术的同时，共转化小麦转录因子 GRF4 及其辅因子 GIF1 以促进再生，可将转化效率从约 5% 提高到 77%。最近，通过在农杆菌中表达丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的 III 型分泌系统来传递能够阻断植物基础免疫的效应蛋白 AvrPto，小麦的转化效率从 16% 提高到了 63%。现在存在一种有趣的可能性，即可以将这两种技术结合起来，以实现更高的转化效率。
转化效率还受二元载体拷贝数以及 T - DNA 插入片段大小的影响。在提高主要谷类作物中小 DNA 片段（最大达 30kb）的转化效率方面已经取得了重大进展。然而，较大片段（最大达 100kb）的转移仍然是个问题，因为 T - DNA 尺寸的增加会导致感染前生成的 T - DNA 链数量减少。通过延长对农杆菌的乙酰丁香酮处理时间，可以增加 T - DNA 链的积累，这或许能够提高大转基因片段的转化效率。
转化多基因叠加组合可确保共分离，并便于在后续育种计划中在不同品种间传递多基因性状（图 1）。然而，一个叠加组合所能携带的基因数量受到二元载体大小限制以及农杆菌将大的 T - DNA 导入宿主基因组能力的双重约束。要培育出包含上述所有理想性状的超级小麦，就需要对多个基因叠加组合进行转化。反过来，这就要求实施一种能确保所有叠加组合共分离的策略。在此，作者考虑两种方法，作者将其称为（a）随机整合法和（b）靶向基因叠加法。
在随机整合法中，各个基因叠加组合被随机转化到小麦基因组中。通过将高效转化与高通量的 T - DNA 插入位点鉴定相结合，可以筛选出在遗传上紧密相邻的整合事件（图 3a）。由于基因组中不同区域的重组频率并不均匀，限制转基因分离的最大物理距离会因它们所插入的染色体以及染色体区域的不同而有所变化（图 3b）。基于对二倍体一粒小麦中 15919 个重组断点的序列分析，大约 50% 的小麦基因组（即着丝粒和近着丝粒区域）很少发生重组。通过对用 200062 个单核苷酸多态性标记进行基因分型的 371 份六倍体小麦地方品种的历史重组（连锁不平衡）情况进行检测，也印证了这一观察结果。因此，有理由预期通过连续多轮的转化，可以实现在同一个重组冷点进行 T - DNA 插入。
靶向基因叠加法则利用了现有的各种可实现转基因精确、靶向整合的技术。例如，在存在与靶区域两侧区域具有同源性的 DNA 模板的情况下，CRISPR - Cas 诱导的双链断裂可通过同源定向修复实现整合（图 3c）。然而，在植物中，通过该途径进行 DNA 损伤修复的频率较低，导致整合效率也较低。最近，通过将引导编辑（prime editing）与位点特异性重组酶（SSRs）相结合，克服了这一局限。引导编辑是一种精确的基因组编辑技术，无需制造双链断裂就能对碱基进行改变以及产生短的 DNA 插入或缺失。位点特异性重组酶能够基于特定的重组位点介导两个 DNA 分子之间的 DNA 交换。在一项结合这些技术的研究中，先利用引导编辑在目标位置创建一个位点特异性重组酶的重组位点，然后利用位点特异性重组酶将一个 11.1kb 的供体 DNA 片段整合到水稻基因组中（图 3c）。这种方法的主要缺点在于需要创建一个靶位点，而且基于重组的叠加组合在大小方面存在限制，具体限制大小目前尚不清楚。
在转基因位点的精确位置不重要的情况下，随机整合法和靶向基因叠加法也可以结合使用：在第一轮转化中，可以通过农杆菌介导转化，以随机的方式将基因叠加组合引入小麦，并且在叠加组合的一端设置一个靶位点；然后，这个位点可用于后续通过位点特异性重组酶进行叠加（图 3d）。
6. 应对知识产权格局
专利是由特定辖区的法律权威机构授予的，自申请日起通常在 20 年内对一项发明享有独占权。专利授予所有者对未经许可便从该项技术中获取经济利益的任何一方采取法律行动的权利。尽管专利机构遵循的程序以及可被知识产权（IP）权利涵盖的产品和技术范围存在基本共识，但每个辖区都有各自的一套法律和规范。因此，在多个辖区寻求知识产权保护时，必须进行逐案分析。生物技术领域的知识产权申请通常涉及核苷酸和氨基酸序列、微生物与病毒，以及诸如诱变、转化和组织培养等获取植物的人工方法。
2013 年，在美国 “分子病理学协会诉麦利亚德基因公司” 一案中，美国最高法院裁定，分离出的 DNA 序列不能被授予专利，因为它们属于 “自然产物”。尽管如此，这并未阻止 11 家机构在美国就 14 个已克隆的锈病抗性（R）基因的使用申请专利。随后，其中 9 项专利获得了批准（图 4a）。生物技术项目通常需要多年的研发和测试，随后还要经历监管审批阶段，这大大增加了产品推向市场的时间。因此，一些最早克隆的锈病 R 基因（例如，2008 年申请专利的 Lr34）的相关专利有可能在其商业开发利用之前就失效了（图 4b）。所以，一个强有力的知识产权保护策略能够减轻与这些专利及研发投资相关的商业风险。
在过去十年中，有关小麦锈病 R 基因的已发表发现成果日益增多。2000 年至 2010 年间仅有 5 项研究成果发表，而 2011 年至 2020 年间则有 21 项研究成果发表。而且，仅在本十年的前三年，就已经描述了 16 个新克隆的基因，这一趋势证实了相关成果数量不断上升，也意味着未来几年还会有更多的基因被克隆出来。这为挑选最佳的候选基因来培育具有更强且持久锈病抗性的小麦品种提供了令人振奋的机遇。
然而，自 2009 年以来，几家参与克隆锈病 R 基因的科研机构已为它们的发现成果寻求知识产权保护，从而导致了复杂的知识产权格局（图 4）。53% 的已克隆基因在至少一个辖区已获得专利或有望获得专利（图 4c）。75% 具有知识产权状态的基因由相同的一两家机构持有或共享，其余基因则由另外八家机构控制或共享。在构建的基因叠加组合中平衡单个基因组合的有效性与知识产权格局所施加的限制，对于商业化或公益性推广具有抗锈病工程性状的小麦品种来说，可能会构成严峻挑战。相反，知识产权所有权也可作为一种管理工具，防止无效基因叠加组合的应用，从而延长已克隆基因的使用期限。
图4. 小麦抗锈病基因的知识产权（IP）格局
7. 监管挑战会使推广和商业化变得复杂
自 1994 年转基因番茄 “Flavr Savr”首次商业化以来，受理想性状引入的推动，转基因作物的种植量出现了激增。在所有获批种植的 390 个转基因事件中，63% 涉及除草剂耐受性和抗虫性，而与非生物胁迫耐受性、抗病性以及改良营养成分相关的性状加起来仅占 17%。
在这一充满希望的形势下，生物技术作物商业化推广的漫长过程中仍存在一个显著挑战。在阿根廷，将 HB4 小麦推向农民田间耗时 15 年。同样，对于 “黄金大米 2 号”，从实验室研发到在菲律宾获批，历经了 16 年。这段时间的很大一部分都用于对环境影响以及食品和饲料消费安全性进行细致的风险评估。平均而言，澳大利亚、新西兰、巴西、加拿大和美国的监管机构需要两年时间来评估相关申请。相比之下，欧盟的这一评估过程可能耗时五年以上。这些评估侧重于分子特性鉴定、表型和农艺性状数据、新蛋白质及其表达水平的评估，以及食品和饲料的生化成分（包括营养和毒理学方面）。
除中国外，数据生成的责任通常落在开发者身上。为缩短商业化推广的时间线（图 5），这种文件记录过程应与技术研发同步进行。例如，在转化后的初始阶段，新的抗锈病转基因植株可以针对特定病原体小种进行筛选，这既可以作为技术可行性的证明，也有助于挑选最有利的转化事件。同时，应提前收集与插入片段完整性、性状分离以及信使核糖核酸（mRNA）表达水平相关的分子数据，并将其用于转化事件筛选以及后续的注册要求。
图5. 小麦转基因事件监管评估的数据收集方案
一旦有足够的种子可用于田间试验，就可以在田间试验中将其表现与亲本野生型种子以及一系列常规品种的种子进行对比。然后记录产量、产量构成要素、农艺和表型特征以及由病虫害和非生物胁迫因素造成的损害等参数。通过研究从试验田收集的节肢动物种群的变异性，可以评估生态相互作用。田间评估的最后阶段可以在多个地点进行，包括对收获样本中转基因草料和籽粒的成分进行生化研究。蛋白质特性鉴定涉及对引入蛋白质的表达水平进行定量分析，并研究其致敏性、消化性和蛋白水解稳定性。最后，通过对实验啮齿动物进行毒性研究，并结合家畜的营养学研究，来完善数据集。
8. “同一健康” 超级小麦有望实现
尽管热浪和干旱导致的小麦损失常常占据新闻头条，但病虫害对全球小麦产量的重大影响却往往未受到公众关注。育种公司投入大量资源通过常规方法培育抗病品种。遗憾的是，这限制了针对其他同样关键性状的育种能力。
基因工程构建的基因叠加组合为防控诸多病虫害、减轻环境胁迫影响以及增强关键营养性状提供了直接的解决方案（图 6）。在这些基本问题得到解决后，育种工作便可聚焦于对其他复杂的多基因性状进行精细调整，最终提高产量和终端使用品质。然而，以一种有利于在育种计划中进行高效管理的方式导入大型多基因叠加组合，却代表着技术工程方面的挑战。展望未来，利用人工微型染色体来传递定制化的基因组合或许能够解决这一瓶颈问题。
图6. “同一健康” 超级小麦概念
在这一充满希望的前景下，与针对转基因植物的严格监管框架保持一致至关重要，要确保上游的研究和工程工作能够助力下游的育种以及转基因事件的解除管制。三十多年前制定的关于转基因作物的预防原则，应当根据这期间积累的经验加以修订。此外，已克隆的 R 基因所处的复杂知识产权格局，引发了人们对于这一法律框架究竟能在多大程度上产生益处，而非阻碍新技术应用的疑问。不过，人们也承认，知识产权可被用于限制不负责任地推广仅依赖少数基因的抗性小麦品种。
对自然和农业生态系统的深入理解必须融入到减轻农业影响的新策略制定当中。这种融合能够促进土壤、作物、水源以及荒地的健康，契合 “同一健康” 理念，使当代人和子孙后代都能从中受益。在此背景下，社会能够从依赖化石燃料的饮食模式转向依靠阳光维持的饮食模式，以实现可持续的未来。
