2025年1月22日，中国科学院遗传与发育生物学研究所刘志勇团队联合英国The Sainsbury Laboratory Jonathan Jones团队、南京师范大学韩管助团队、河南科技学院胡铁柱团队合作在Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了题为“The wheat NLR pair RXL/Pm5e confers resistance to powdery mildew”的研究论文。该研究发现以“头对头”的方式紧密相连的两个NLR (nucleotide-binding and leucine-rich repeat)基因RXL和Pm5e，以NLR pair的形式共同介导小麦白粉病抗性(Guo et al. 2025)。RXL和Pm5e均编码非典型的NLR蛋白，其中RXL含有一个截短的NB-ARC结构域，而Pm5e则含有非典型的CC结构域。进一步研究表明，RXL和Pm5e更倾向于形成异源复合物，并且Pm5e的CC结构域通过竞争性相互作用特异抑制由RXL的CC结构域引发的HR反应，揭示了该NLR pair可能的免疫调控机制。该研究首次发现并解析了NLR pair调控小麦抗病性的遗传和分子机制。
小麦(Triticum aestivum)是全球三分之一人口赖以生存的主要粮食作物，由Blumeria graminis f. sp. tritici (Bgt)引起的小麦白粉病是一种流行病，导致总产量损失约10%-40%。抗病基因在作物病害控制中起着至关重要的作用，培育和推广抗病品种是农业生产中减少农药使用的关键措施。目前已克隆的小麦抗病基因大多编码CNL(CC-NLR)蛋白。研究发现一些CNLs蛋白，如拟南芥中的ZAR1和小麦中的Sr35被激活后形成车轮状的五聚体复合物，简称为抗病小体(resistosomes)的结构，通过其CC结构域插入质膜，形成Ca2+通道，引发Ca2+内流，从而激活免疫反应。在大多数情况下，单个NLR能够同时识别病原菌中的效应因子并启动免疫反应。然而，一些情况下需要两个NLR以NLR pair的形式发挥作用，其中一个NLR蛋白称为感受器sensor NLR，通常通过整合结构域(Integrated domain，ID)识别病原菌中的无毒基因(AVR)，而另一个NLR蛋白称为executor NLR，也称为helper NLR，负责启动免疫反应。这些NLR pair在基因组上往往紧密连锁。如水稻中RGA4/RGA5和Pik-1/Pik-2的NLR pair能够通过整合的重金属相关(HMA)结构域识别来自稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的效应因子；在拟南芥RPS4/RRS1的NLR pair中，RRS1是感受器NLR，能够通过整合的WRKY结构域直接识别来自丁香假单孢菌(Pseudomonas syringae pv. pisi)的AvrRPS4和来自青枯菌(Ralstonia solanacearum)的PopP2。尽管之前曾经有报道抗叶锈病基因位点Lr10存在具有NLR pair特征的Lr10和RGA2蛋白，但缺乏后续的功能验证，Lr10和RGA2之间的关系及其与叶锈病抗性之间的关系缺乏深入了解。
刘志勇课题组之前图位克隆了来源于中国小麦地方品种的抗白粉病基因Pm5e，发现其编码NLR蛋白，位于该NLR蛋白C末端的一个氨基酸变异对其抗病功能至关重要(Xie et al. 2020)。有意思的是，另一个NLR编码基因RXL(Rx-CC-like)与Pm5e以“头对头”的形式排列。当单独将Pm5e转化至高感白粉病品种Fielder时，含有Pm5e的阳性转基因植株表现出对白粉病的高度抗性，而单独在Fielder中表达RXL的转基因植株并未表现出白粉病抗性；同时，高感白粉病的小麦品种中国春中的RXL(RXL-CS)基因与RXL序列完全相同。根据这些证据，我们曾认为Pm5e可以独立发挥抗病功能。然而，进一步的研究发现有4个EMS感病突变体在RXL基因上存在非同义突变，而在Pm5e基因上未发生突变，这促使我们进一步探讨RXL和Pm5e是否作为NLR pair发挥抗白粉病功能？
1. RXL和Pm5e共同赋予小麦对白粉病的抗性
RXL和Pm5e以“头对头”的方式排列，它们的起始密码子之间仅间隔1387 bp(图1a)。在接种白粉病菌后，RXL和Pm5e表达均显著上调，表明其在转录水平上受到共同的调控。为了研究RXL和Pm5e是否作为NLR pair协同发挥抗白粉病功能，对含有RXL和Pm5e的抗病材料复壮30 (FZ30)和唐麦4号(Tangmai 4, TM)进行了EMS诱变，共筛选出5个独立的RXL感病突变体，以及9个独立的Pm5e感病突变体。这些突变体分别在RXL和Pm5e基因中发生非同义突变(图1a，b)。序列扩增发现，Pm5e在5个RXL突变体中均未发生突变，而RXL在9个Pm5e突变体中也均未发生突变。为了验证突变体抗病性丧失与RXL或Pm5e突变之间的因果关系，我们选择纯合RXL感病突变体(M1650、M3274和M3289)和Pm5e感病突变体(M608和M1006)，分别与相应的野生型(FZ30或TM)进行杂交，构建出遗传分离群体。所有来自五个分离群体的F2:3代家系均表现出纯合高抗：抗感分离：纯合高感为1:2:1的分离比，表明该突变均由单基因控制。根据RXL或Pm5e基因突变位点设计的特异SNP标记在相应的分离群体中均与表型共分离，这表明RXL和Pm5e对白粉病的抗性都是必需的。
为了进一步验证RXL和Pm5e对白粉病抗性的遗传互作，选择了2个RXL功能丧失突变体(M3274和M3289)与3个Pm5e功能丧失突变体(M608、M1006和M2586)进行相互杂交，同时将不同RXL突变体之间的杂交，以及不同Pm5e突变体之间的杂交作为对照。结果表明，不同RXL突变体之间的杂交F1，以及不同Pm5e突变体之间的杂交F1均表现高感白粉病，而RXL和Pm5e突变体间杂交F1表现出显著提高的白粉病抗性水平(图1c)，说明RXL和Pm5e在抗病功能上相互依赖。进一步利用大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默(BSMV-VIGS)、CRISPR/Cas9(图1d, e)和RNA干扰(RNAi)(图1f, g)等多种方法均证明了RXL和Pm5e共同介导对小麦白粉病的抗性。
图1 RXL与Pm5e NLR pair的功能验证
2. RXL和Pm5e编码非典型的CNL蛋白
采用AlphaFold2预测了RXL和Pm5e的蛋白结构(图2a，d)。RXL蛋白含有典型的CC结构域(图2b)、截短的NB-ARC结构域(图2c)，以及具有15个重复的LRR结构域，而Pm5e蛋白则含有非典型的CC结构域(图2e)，典型的NB-ARC结构域(图2f)，以及具有17个重复的LRR结构域。此外，Pm5e蛋白C端还包含一个无序区域(IDR)(图2d)。RXL的CC结构域与典型CNL ZAR1的CC高度相似，二者均包含四个α螺旋(图2b)。CC的第一个螺旋(α1)，在Ca2+通道形成中发挥重要作用，在非典型的Pm5eCC与典型的ZAR1CC之间具有显著的差异(图2e)。Pm5e含有完整的NB-ARC结构域，与ZAR1NB-ARC非常相似(图2f)，而RXL的NB-ARC结构域仅包括WHD区域，缺少NBD和HD1结构域，即缺失了一些重要的组分，如P-loop、RNBS-A、Kinase 2、RNBS-B、RNBS-C和GLPL基序(图2c)。NB-ARC结构域在CNL寡聚化过程中起着关键作用，帮助ZAR1和Sr35抗病小体的形成。这些结果表明RXL和Pm5e蛋白在功能上可能相互依赖。
图2 RXL与Pm5e 结构域的预测
3. RXL和Pm5e倾向于形成异源复合物
利用AlphaFold-Multimer(AFM)预测了RXL和Pm5e之间的互作关系。AFM预测RXL-Pm5e异源二聚体的总得分为0.86，而RXL-RXL和Pm5e-Pm5e同源二聚体的评分分别为0.43和0.63，均低于RXL-Pm5e异源二聚体的评分(0.86)，表明RXL和Pm5e更倾向于形成异源复合物。之后利用Co-IP、BiFC及分裂荧光素酶等多种实验验证了RXL和Pm5e既可以形成异源复合物，也可以形成同源复合物(图3a-c)。
图3 RXL与Pm5e NLR pair的互作
为了进一步探讨RXL和Pm5e是否倾向于形成异源复合物，对Pm5e-HA与RXL-nLUC/RXL-cLUC，或RXL-HA与Pm5e-nLUC/Pm5e-cLUC进行了共表达，使用HA标签的GUS作为对照。与对照相比，RXL-nLUC/RXL-cLUC的结合荧光素酶信号在加入Pm5e-HA后有所减少，且Pm5e-nLUC/Pm5e-cLUC的信号在加入RXL-HA后也有所减少，RXL-nLUC/RXL-cLUC和Pm5e-nLUC/Pm5e-cLUC的蛋白表达水平没有显著变化(图3d-g)。这些结果表明，RXL和Pm5e更倾向于形成异源复合物。为了进一步确定RXL和Pm5e是否在体内形成异源寡聚物，进行了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN-PAGE)实验。结果表明，RXL-Pm5e异源寡聚物的分子量范围为800到1048 kDa，与预测的RXL单体(~73 kDa)和Pm5e单体(~119 kDa)的分子量形成鲜明对比(图3h)。这些结果表明存在RXL-Pm5e异源寡聚体。
4. Pm5eCC通过竞争性与RXLCC相互作用特异性抑制由RXLCC引发的HR
CC结构域在NLR pair形成同源和异源复合物中发挥重要作用，进一步利用酵母双杂交系统及分裂荧光素酶实验证明了RXL和Pm5e可以通过各自的CC结构域形成同源和异源复合物(图4a,b)。在ZAR1抗病小体中，ZAR1的NB-ARC结构域促进ZAR1的寡聚化，而ZAR1CC的α1作为Ca2+通道，引发Ca2+内流，进而激活免疫反应。考虑到RXLCC与ZAR1CC相似(图2b)，而Pm5eCC的α1与ZAR1CC具有显著差异(图2e)，因此检测了RXLCC和Pm5eCC与全长RXL和Pm5e蛋白的HR反应。结果表明，全长的RXL和Pm5e蛋白均未引起HR，只有RXLCC引起显著的HR，Pm5eCC则未表现出明显的表型(图4c)。进一步研究发现，Pm5eCC可通过竞争性与RXLCC相互作用，特异性抑制由RXLCC自身互作引发的HR，表明RXL可能作为executor NLR，即helper NLR， 而Pm5e作为sensor NLR。
图4 RXL和Pm5e的CC结构域间互作验证
5. RXL/Pm5e是在小麦族分化之前就已存在的“头对头”NLR pair
通过相似性搜索和系统发育分析探讨了RXL/Pm5e同源NLR pair在122种代表性植物物种中的进化轨迹，这些物种涵盖了植物的主要多样性，包括34种禾本科物种。RXL同源基因在芒种草(Miscanthus sinensis)和所有分析的Pooideae物种中均被发现(除多年生黑麦草外)。然而，M. sinensis的RXL同源基因位于Pooideae中RXL同源基因的多样性中，表明RXL同源基因可能是通过水平基因转移从Pooideae中演化而来。综合来看，RXL同源基因可能是在Pooideae的最后共同祖先(LCA)之前，通过NB-ARC结构域的退化由祖先CNL基因进化而来。
RXL同源基因的拷贝数在不同物种中有所不同，从大麦(Hordeum vulgare)中的单拷贝到中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)中的18拷贝不等。相比之下，Pm5e同源基因通常以单拷贝基因存在，除了一些由于多倍化而具有多个拷贝的小麦亚科物种，如普通小麦(T. aestivum)和斯卑尔脱小麦(T. spelt)(图5)。为了进一步阐明RXL和Pm5e之间的物理关联，对13种代表性单子叶植物的NLR蛋白进行了系统发育分析。结果表明，RXL相关和Pm5e相关基因之间的“头对头”关系已经持续了很长时间，RXL/Pm5e同源基因之间的物理关联可以追溯到一个祖先的“头对头”NLR pair，这个NLR pair可能是在禾本科早期进化过程中，约8250万年前(Mya)在服叶竺亚科(Pharoideae)和其他禾本科(Poaceae)物种分化后出现的(图5)。
图5 RXL与Pm5e NLR pair的协同进化
中国科学院遗传与发育生物学研究所博士后郭广昊、郑州大学助理研究员白凯红、中国科学院遗传与发育生物学研究所在读博士生侯艺堃、南京师范大学青年教师宫震博士为论文共同第一作者，中国科学院遗传与发育生物学研究所刘志勇研究员、The Sainsbury Laboratory Jonathan Jones教授、南京师范大学韩管助教授、河南科技学院胡铁柱教授及中国科学院遗传与发育生物学研究所博士后郭广昊为论文共同通讯作者。该研究得到国家重点研发专项等项目的资助。
参考文献
Xie J. et al. (2020) A rare single nucleotide variant in Pm5e confers powdery mildew resistance in common wheat. New Phytol 228:1011-1026
Guo G. et al. (2025) The wheat NLR pair RXL/Pm5e confers resistance to powdery mildew. Plant Biotechnol. J., https://doi.org/10.1111/pbi.14584
