2024年，Victor Ambros 和 Gary Ruvkun 因发现微小RNA（microRNA）及其在转录后基因调控中的作用而获得诺贝尔生理学或医学奖。microRNA作为一种关键的基因表达调控因子，已被广泛研究，揭示了RNA在细胞功能中的重要作用。这一奖项不仅表彰了microRNA的发现，也再次突显了RNA调控在基因表达中的重要地位。
微小RNA是非编码RNA家族的一员，它通过直接与靶mRNA相结合来调控基因表达。类似地，另一类非编码RNA——LncRNA（长链非编码RNA），虽然在结构和功能上有所不同，但也在基因表达的转录后调控中扮演着重要角色。随着对非编码RNA功能的深入了解，LncRNA逐渐被认为是基因调控中的一个关键因子。由于lncRNA的功能复杂、作用隐匿且尚未完全揭示，它们在基因研究中长期处于“隐性”状态，直到近年来才逐渐被揭示为调控生命过程中不可或缺的一部分。因此，它们也被称为基因研究中的“暗物质”。正如天文学中的暗物质虽然看不见，但对宇宙的形成和演化起着重要作用，lncRNA在细胞内的调控机制和生物学功能也可能在很多生命现象中发挥着至关重要的作用，仍是当前分子生物学和基因组学研究的热点之一。
2015年4月9日，Cell在线发表了题为“Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins”的论文。利用团队开发的Chirp-MS技术系统地发现与LncRNA Xist 相互作用的蛋白质，从而深入理解X染色体失活过程中的分子机制，并为LncRNA研究提供了新的思路。
Howard Y. Chang教授是基因组学和非编码RNA研究领域的领先科学家之一。他在这些领域的开创性工作不仅推动了我们对基因表达调控的理解，尤其是在LncRNA的作用机制方面，还为癌症治疗等领域提供了新的思路和潜在的治疗靶点，对基础生物学研究和临床医学产生了深远的影响。
图形摘要
Xist RNA是X染色体失活过程中关键的非编码RNA，它通过招募多个蛋白质和形成大规模的RNA-蛋白复合体，驱动X染色体的失活。尽管已有研究表明，Xist RNA通过与多个蛋白质相互作用来发挥其功能，但对这些蛋白质的全面系统性探索依然有限。为了进一步理解Xist的分子机制，进行了一项系统性研究，目的是发现Xist RNA的结合蛋白，并揭示这些蛋白在X染色体失活中的作用。
研究设计及方法
一、明确研究目标：系统识别与Xist RNA结合的蛋白质，揭示其在X染色体失活中的作用。
二、实验筛选：通过高通量的RNA免疫共沉淀（RIP）和质谱分析，初步筛选与Xist RNA结合的蛋白质。
三、实验验证：通过不同的实验方法验证筛选结果，确保所筛选的蛋白质确实与Xist RNA结合。
四、功能注释与分析：对筛选出的蛋白质进行功能注释和富集分析，探索它们在X染色体失活中的潜在作用。
五、综合分析和结论：结合实验结果和生物信息学分析，揭示Xist RNA结合蛋白的功能和作用机制。
通过这一系列系统的筛选和分析，研究人员能够建立起Xist RNA及其结合蛋白在X染色体失活中的调控机制，从而为后续的相关研究提供了基础数据和理论框架。
主要结果
1、ChIRP-MS方法及其应用
ChIRP-MS（Chromatin Isolation by RNA Purification coupled with Mass Spectrometry）方法是对ChIRP-seq（Chromatin Isolation by RNA Purification）技术的扩展，专门用于鉴定与长链非编码RNA（lncRNA）相关的蛋白质。该方法的流程如下：
（1）甲醛交联：通过使用甲醛广泛交联细胞中的RNA和蛋白质，固定RNA与其相互作用的蛋白。
（2）RNA捕获：设计寡核苷酸探针与目标RNA（如lncRNA或snRNA）结合，富集目标RNA及其相关蛋白质。
（3）温和洗脱：使用生物素洗脱技术释放与RNA结合的蛋白质。
（4）LC-MS/MS 分析：通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术鉴定回收的蛋白质。
研究团队首先通过对HeLa S3 细胞中的U1和U2小核RNA（snRNA）进行ChIRP-MS实验来验证该方法的有效性和特异性。由于U1和U2 snRNA的表达量较高且它们的剪接体组成已知，这使得它们成为测试ChIRP-MS技术的理想对象。通过对U1和U2的ChIRP-MS分析，作者发现：U1和U2 snRNA不仅共享大量的RBP，还在剪接体复合物、SMN复合物和帽结合复合物等不同功能复合物中发挥作用。并且，ChIRP-MS方法揭示了这些蛋白质在mRNA剪接及其后期加工中的重要性。
图1 Chirp-MS工作流程及U1、U2结果分析
为了进一步验证ChIRP-MS方法的特异性和可靠性，研究者采用了多个对照策略.通过银染分析，观察U1和U2的ChIRP样品与阴性对照样品之间的差异。结果显示，U1和U2的探针能够有效提取富集蛋白质，而对照探针则未提取到任何富集蛋白，表明该方法具有较高的特异性。不同的对照策略（如RNase处理和非靶向探针）之间的结果具有98%（U1）和99%（U2）的重叠，验证了该方法的稳健性和高重复性。
同时发现表明U1具有超出传统剪接功能的非经典作用，这一新功能可能为进一步研究U1的生物学作用提供了新的方向。通过优化的ChIRP-MS技术，研究团队成功地鉴定了多个与U1和U2 snRNA相关的蛋白质，进一步揭示了这些蛋白在剪接及其他RNA处理过程中的关键作用。这些研究成果不仅验证了ChIRP-MS方法在RNA结合蛋白鉴定中的有效性，还揭示了snRNA的新功能，丰富了我们对RNA在基因表达调控中的多样化作用的理解。
图2 U1、U2差异结合蛋白组及特异性
2、发现多个Xist RNA结合蛋白
在Neuro2a雌性小鼠细胞系中，Xist RNA被超声处理完全溶解。超过60%的Xist RNA被有效检索，且没有富集Gapdh mRNA作为对照。通过ChIRP-MS实验，研究人员识别到Xist RNA结合的主要蛋白质，包括HnrnpK、HnrnpU、HnrnpM等。这些蛋白质涉及多个细胞过程，包括RNA加工、转录调控、染色质修饰等。通过该方法，表明，Xist RNA不仅与少数蛋白质相互作用，而是与多个细胞内的蛋白质形成一个复杂的蛋白质网络，这些蛋白质共同协调X染色体失活的过程。
进一步的描述了Xist RNA 在不同生物系统中的逐步调节和组装过程，特别是 Xist 介导的 X 染色体失活（XCI）的不同阶段。通过使用 Xist ChIRP-MS（Chromatin Isolation by RNA Purification with Mass Spectrometry）技术，研究者们研究了 Xist 在小鼠胚胎干细胞（ESC）、上皮干细胞（EpiSC）、以及滋养层干细胞（TSC）中的相互作用，揭示了 Xist 结合蛋白的发育性调控和组装过程。描述了了 Xist 通过逐步调节其伴侣蛋白的组装过程，如何在不同的发育阶段控制 X 染色体的沉默。
图3 Xist Chirp-MS及Xist结合蛋白的发育性调控和组装过程
3、HnrnpK在Xist介导的基因沉默中的作用
研究首先通过靶向一些Xist相互作用蛋白，特别是HnrnpK，评估它们在Xist介导的基因沉默中的重要性。使用双色RNA-FISH技术，结合基因组（BAC）探针，检测Grb10基因的转录活动。在HnrnpK耗竭的情况下，Grb10基因的转录活性显著增加，表明HnrnpK的缺失使得Xist介导的沉默对Grb10不再敏感。
研究还在EpiSC模型中验证了HnrnpK对内源性XCI（随机X失活）的影响。HnrnpK和HnrnpU的耗竭在EpiSC中也导致了XCI效率的降低，进一步证明了HnrnpK在Xist介导的染色质修饰中的重要作用。结果表明，HnrnpK和HnrnpU在Xist介导的Grb10基因沉默中起着重要作用。
图4 HrnpK功能研究
4、Xist A-repeat与Spen相互作用参与X染色体失活（XCI）过程中的基因沉默
Xist的5'端有一个包含保守A重复元件的小区域，虽然这一序列对转录沉默至关重要，但并不参与染色质相互作用或X染色体扩散。研究表明，缺失A重复序列可能会改变Xist的RNA结构，影响沉默蛋白的结合。研究发现A重复序列缺失显著影响了Spen、Rnf20和Wtap与Xist的结合，尤其是在ESC分化过程中，Spen与Xist的相互作用增强。ChIRP-western实验：证实Spen与全长Xist结合时是排他性的，不与A重复突变体结合。HnrnpK的结合不依赖于A重复序列，进一步表明不同沉默蛋白与Xist的结构域结合是特异性的。
Spen是Xist介导转录沉默的重要因子。消耗Spen而非其他蛋白质（如Rnf20、Rnf40）会显著减少Xist介导的X连锁基因Pgk1的沉默。Spen耗竭还会减少X连锁基因Mecp2和Rnf12的沉默，提示Spen对转录沉默至关重要。Spen耗竭导致Xist包被的非活性X染色体上出现更多新生转录，进一步证明Spen对于转录沉默是必需的，但不直接参与Xist RNA的积累或跨染色体传播。Spen通过其RNA识别基序（RRM）与Xist的A重复序列直接结合。
实验表明，Spen RRM结构域优先结合Xist的A重复区域，而非GFP mRNA，进一步支持了Spen与Xist的A重复区域直接相互作用。揭示了Xist的A-重复序列在Xist与多个沉默蛋白（如Spen、Rnf20、Wtap）相互作用中的关键作用。Spen通过直接与Xist的A重复区域结合，促进Xist驱动的基因沉默，但并不参与Xist RNA的积累或其在染色体上的传播。Spen的作用主要通过调控转录沉默机制，影响X染色体失活过程。
图5 Spen 与 Xist 的 A 重复序列结合
总结:
这篇文章提供了关于Xist RNA与其结合蛋白的全面分析，揭示了Xist在X染色体失活中的多层次作用，不仅限于染色质重塑，还可能通过RNA代谢等途径调控基因表达。这些发现为我们深入理解lncRNA调控机制及X染色体失活机制提供了新的分子基础，并为相关疾病的研究和治疗提供了潜在的靶点。
对于小麦研究的一些启发：
（1）小麦lncRNA与基因沉默的关系：
类似于Xist在XCI中的作用，小麦中的某些lncRNA可能通过与沉默因子结合，调控抗病性基因、发育基因或环境适应性基因的表达。通过这种方式，lncRNA可能在小麦的抗病性、发育调控及环境适应性中发挥关键作用。
（2）功能鉴定的新方法：
ChIRP-MS技术为小麦lncRNA相互作用组的全面分析提供了一个有效的策略。该方法可以帮助识别小麦lncRNA与其他RNA或蛋白质的相互作用，并揭示它们在细胞内的作用机制。通过这一方法，研究人员可以深入了解lncRNA在小麦中的功能，并推动其在基因调控和疾病抗性中的应用研究。
这些启发为小麦lncRNA研究提供了新的方向，特别是在抗病性、发育和表观遗传调控等领域的潜在功能，表明lncRNA在小麦育种和改良中的重要角色。
总之，文章中对Xist的研究为小麦中的lncRNA研究提供了理论框架和技术路线，尤其是在理解lncRNA在基因表达调控和表观遗传中的作用方面。这不仅有助于揭示lncRNA在小麦中的功能，也为未来的小麦育种和抗逆性改良提供了新的视角和方法。
文章链接：http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.03.025
