作者选择了基因组已测序的的异源六倍体小麦品种中国春（CS）为植物材料，收集了4日龄幼苗的40个根尖（长1厘米）进行了scRNA-seq，成功捕获了13063个细胞，细胞平均检测到2523个基因，基因的中位数为1851，表明作者获得了高质量的细胞，确保了scRNA-seq数据集的可靠性。根据表达模式的相似性，所有细胞可被聚为19个簇，对应12种细胞类型（图1a）。
2.小麦根的细胞类型集群的鉴定
作者将CS与其他栽培种（AK58）和物种（水稻、玉米和拟南芥）的根尖集群特异标记进行了同源性比对，并检测了它们的表达模式。通过总结scRNA-seq非根尖研究中报道过的同源基因的生物功能和表达模式（图1 c），以及每个集群的GO富集分析的结果进行集群注释。原位杂交结果表明，50个集群特异性标记中只有9个显示了相应的特异性表达（图1 d）。
根据集群特异性标记的表达部位以及各集群中富集的基因的功能和注释以及表达模式，集群分别被注释为：9 干细胞龛（SCN）；7 近端分生组织；12 分生组织；10 表皮；16 非根毛；8 根毛；15 内皮层；3 和4 皮层；5 韧皮部；13 木质部的薄壁细胞和管胞（TEs）；2和14 木质部的纤维细胞（FCs）；集群1被划分为4个子集群（1.1,1.2,1.3,1.4），其中1.1和1.3被标记为集群1-1，注释为木质部样，1.2被标记为集群1-2，注释为皮层样，1.4被标记为集群1-3，注释为中柱样；此外11由于缺乏特异性标记被注释为未知集群。此外作者还描述了研究中产生的集群前10个特异性标记基因的表达模式（图2）。
3.SCN和分生组织细胞的分化轨迹重建
为揭示SCN（集群9）、近端分生组织（集群7）和分生组织（集群12）背后的连续生物过程，作者对三个细胞群的分化轨迹重建。结合拟时序如图2 a，集群9中的细胞处于推断轨迹的开始，集群7和集群12在两个不同的分支上进行排序（图3 b）。轨迹上细胞类型标记基因的表达表明SCN在分支前端高转录，随着拟时序发展，信号逐渐减弱（图3 c）。高变异基因根据平均表达水平被分为四个模块，在前分支的模块1中，编码生长素应答蛋白的基因高表达，根静止中心（QC）及其细胞下方的生长素最大值是非常重要的。分支1中，模块3高度富集了与QC中PLT2激活相关的色氨酸代谢过程途径、生长素介导的信号途径调控和与QC调控相关的乙烯激活信号途径。从前分支到分支1这段拟时序的GO富集变化揭示了从SCN到近端分生组织的过渡状态细胞的存在。模块4的GO富集表明近端分生组织细胞正在进行细胞分裂。在分支2中，模块2中的细胞也显示了分生组织中细胞分裂的基因特征（图3 f）。因此，作者的研究能够做到细胞从SCN（集群9）向近端分生组织（集群7）或分生组织（集群12）的逐渐过渡，表明了本研究细胞类型注释的准确性和用图谱可实现的潜在分析，并描述了高变异基因在动态过程中的时序表达变化。
图3通过拟时序分析，分析SCN、近端分生组织和分生组织的分化轨迹。
4.跨小麦根细胞类型的水分运输模式
作者检测到22个水通道蛋白（AQPs）基因的表达，并绘制了基因的表达模式（图4 a-d），前人研究表明AtPIP2;1, AtPIP1;2和AtPIP1;5共表达能够增加水的渗透性，单独表达不发挥作用，TaPIP1;5可能与AtPIP1;5一样可能无法单独发挥作用。根据不同集群细胞的基因表达模式可以看出，小麦的根毛（集群8）、皮层（集群3,4）、内皮层（集群15）和非根毛（集群16）细胞分别有独特的水分运输通道，TaPIP1;1无特异性地在每个细胞类型中均有表达。此外，有7个AQP基因在CS和AK58的根尖均有表达（图4 e）。
图4涉及水分转运的基因的表达模式。
5.小麦亚基因组中细胞类型特异性不对称基因的表达
研究表明，TEs、SCN、分生组织、非根毛、内皮层的不对称转录的同源基因百分比高于其他细胞类型（图5 c，d），主要源于三个亚基因组的显性基因的不对称转录的比例高于其他细胞类型（图5 e）。此外CS和AK58两个栽培种的SCN和内皮层的显性基因KEGG分析存在差异（图4 g，h）。
6.小麦栽培种CS和水稻栽培种（Nip和93-11，ZH11）根尖细胞类型的进化保守性与差异
除1-1、1-2、1-3、1-4和11集群细胞类型外，其他小麦根细胞类型均用于后续分析。如图6 b所示，小麦（CS）和水稻（Nip和93-11）的皮层和内皮层的相关性相对较高。在图6 c中，小麦（CS）和水稻（ZH11）的表皮和分生组织具有较高的相似性。在相对高度相关的细胞类型中，将两个物种的保守基因合并，它们的表达模式显示在图6 d的热图模块1和模块2中，表明两个物种之间存在共享的细胞类型标记。此外作者还获得了物种特异性的模块3、4，表明小麦和水稻中存在有差异基因的细胞类型。
此外，作者鉴定了高度的DEGs，总结了变化超过5倍的差异表达基因，它们的表达热图显示出明显的物种相关表达（图7 a，b）。此外作者对两个物种的不同细胞类型中的这些基因进行GO富集（图7 c，d），如乙烯激活的信号通路和对茉莉酸通路的响应在水稻表皮（Nip和93-11）和小麦根毛（CS）中富集（图7c，d）。进行scRNA-seq的数据挖掘能够找到更多关于从细胞类型到基因水平的功能相似性和差异性。
总结与讨论
研究通过scRNA-seq，鉴定了大多数具有细胞类型特异性标记基因的主要细胞类型，揭示了小麦根尖的细胞异质性；阐明了小麦根部不同组织的细胞类型的AQPs水分转运的分子机制；分析了小麦不同细胞类型亚基因组的不对称转录，以及小麦和水稻根尖组织保守和不同的基因表达模式，为单细胞分辨率下的根系发育研究开辟了新的途径。
个人心得与感悟
这篇文章鉴定了到了共12个集群细胞类型的特异性表达基因，将小麦根系不同组织部位如皮层、内皮层等根据细胞类型特异性表达基因区分开，为小麦根系后续的基因表达研究提供了标记基因支持。
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