植物拥有复杂的先天免疫系统，可分为两层。第一层 由模式识别受体（PRR）介导，它们能够识别病原体相关分子模式（PAMP）和损伤相关分子模式（DAMP），从而激活模式触发免疫（PTI）。然而，病原体会分泌效应蛋白来削弱PTI。作为回应，植物利用第二层防线，即细胞内的NLR受体，来识别这些效应蛋白，触发效应子触发免疫（ETI）。ETI通常以超敏反应（HR）为特征，这是一种在感染部位发生的程序性细胞死亡。 NLR蛋白既可以作为独立的受体发挥作用，也可以作为网络的一部分参与免疫反应。拟南芥中ZAR1抗性体的发现，以及随后对这一复合体及其他类似蛋白复合体的生化和结构特征的研究，极大地推动了我们对NLR信号传导的理解。这些研究揭示了NLR激活的保守机制和多样性机制，为植物抵御病原体的免疫反应提供了新的见解。在本综述中，我们总结了关于NLR抗性体的最新发现，重点强调了这些大型蛋白复合体的结构和生化特性。 2025年1月13日，柴继杰课题组在Current Opinion in Structural Biology 期刊发表了题为"Assembly and functional mechanisms of plant NLR resistosomes "的文章。作者总结了关于NLR抗性体的最新发现，重点强调了这些大型蛋白复合体的结构和生化特性， 并对未来研究方向进行了展望。 1、植物NLR结构域 NLR蛋白是进化上保守的免疫受体，存在于各种生物中。这些受体具有三个主要结构域，包括一个可变的N端结构域、一个NOD（核苷酸结合和寡聚化域）模块和一个C端LRR结构域。NOD模块在植物NLR生物学中被称为NB-ARC结构域，它在人类凋亡蛋白Apaf-1和秀丽隐杆线虫的CED-4中也高度保守。这一结构域对ADP或ATP的结合至关重要，这些核苷酸能够稳定NLR的静止态或激活态。 植物NLR蛋白主要分为两类：具有N端卷曲螺旋（CC）结构域的CNL和具有N端Toll/白细胞介素-1受体（TIR）域的TNL。CC结构域在某些CNLs中与RPW8结构域相似，这些CNLs也被称为RNL（下图） 。N端结构域在免疫信号传导中起关键作用，而LRR结构域则通常负责识别病原体效应蛋白。大约10%的植物NLR蛋白配备了额外的整合结构域（ID），例如RRS1中的WRKY结构域和RGA5中的重金属相关（HAM）结构域。这些结构域识别病原体效应子的机制已经得到阐明，尽管其对应NLR的激活过程仍然不明。此外，还有一些非典型的NLR蛋白，它们的C端截短，例如拟南芥中的TIR-only蛋白RBA1。 植物NLR蛋白能够特异性地识别病原体效应子蛋白，这种识别可以是直接的，也可以是间接的。在间接识别模式中，病原体效应子通常会靶向另一种宿主蛋白，这种蛋白被称为“警戒蛋白”或“诱饵蛋白”，它可以被相应的NLR或NLR肽片段结合（下图）。例如，拟南芥中的ZAR1和RPM1以及小麦中的Sr35，能够独立识别病原体效应子，从而触发效应子触发免疫（ETI）。而其他NLR蛋白则需要成对或形成网络才能发挥功能，例如水稻中的RGA5/RGA4、拟南芥中的RRS1/RPS4，以及茄科植物中的NRCs（细胞死亡所需的NLR）（图1b）。其中，sensor NLR（sNLR），如RGA5和RRS1，负责识别病原体效应子，而RGA4、RPS4和NRCs则负责激活下游免疫反应。因此，这些下游NLR也被称为helper NLR（hNLR）。
在识别病原体效应子后，植物NLR蛋白会组装成高阶蛋白复合物，称为抗病小体（下图）。例如ZAR1和Sr35形成的CNL抗病小体 ，它们在质膜（PM）上发挥钙离子（Ca²⁺）通道的功能。相比之下，以拟南芥的RPP1和本氏烟的ROQ1为代表的TNL抗病小体 则作为NADase全酶发挥作用，将NAD⁺转化为第二信使。在拟南芥中，这些TNL NADase全酶通过EDS1及其同源蛋白PAD4和SAG101激活下游的helper NLR蛋白ADR1/NRG1及其钙离子通道活性。最近的研究也证实了NRCs具有类似的抗病小体 和钙离子通道活性。这些数据表明，钙离子信号在启动ETI信号传导中发挥着普遍且关键的作用（下图）。 2、抗病小体激活和组装机制 ZAR1识别效应蛋白AvrAC，ZAR1抗病小体结构的解析，阐明了AvrAC诱导ZAR1激活的机制。在静息状态时，ZAR1与RKS1形成复合物，ZAR1的LRR结构域与RKS1的N端α-螺旋互作，此时 ZAR1结合 ADP，维持自抑制。当病原菌入侵时，效应蛋白 AvrAC 对诱饵蛋白 PBL2激酶进行尿苷单磷酸(UMP)修饰， PBL2UMP 被招募到ZAR1-RKS1复合物，诱导RKS1的激活基序构象变化，促使ZAR1发生核苷酸交换，释放ADP，结合dATP/ATP，随后ZARI蛋白构象发生剧烈变化，并进一步寡聚（五聚 ）形成抗病小体。抗病小体通过 ZAR1 N端α-螺旋形成的漏斗状结构定位于质膜，作为阳离子通道激活钙离子内流和免疫反应。 有趣的是，最近的研究表明，大麦中的CNL MLA13在AvrA13效应子的诱导下也会进入类似的预激活状态。这种抗性体呈现出类似车轮的五聚体结构，与动物NLR炎症体和Apaf-1凋亡体的结构相似。抗病小体 的组装通过dATP或ATP的结合得以稳定。后续对Sr35以及拟南芥中的TNL RPP1和本氏烟中的ROQ1的结构研究表明，ZAR1的激活机制在植物NLR中是保守的。 3、Helper NRC2和NRG4抗病小体 在茄科植物中, helper NRCs构建了一个复杂的网络，汇聚了多个sNLR的信号。冷冻电镜揭示，与其他NLR类似，非活性状态下的NRC2通过其结构域间的相互作用，形成自抑制。然而，与许多其他NLRs不同，非活性NRC2在体外和体内均能形成更高阶的寡聚体，进一步稳定了这种结构域间相互作用介导的自抑制。这一机制与动物NLRP3的自抑制方式颇为相似，后者通过一个由12到16个单体组成的双环笼状结构，封闭N端的pyrin结构域，以避免其过早激活。有趣的是，在非活性状态下，番茄NRC2中结合一个肌醇磷酸（ IP 6/5 ）分子，它在NRC2的激活过程中起着至关重要的作用。然而，IP 6/5 的结合在其他NRC成员中并不保守。进一步的研究将有助于阐明IP 6/5 在NRC2激活中的具体机制。 与ZAR1和Sr35不同，NRC2和NRC4在激活后均形成六聚体抗性体，这表明NLR抗病小体的组装机制具有多样性。尽管结构上存在差异，但NRC2和NRC4的组装模式及其多聚体结构与ZAR1和Sr35的抗性体相似。值得注意的是，sNLR Rx并未在NRC2的抗病小体 中被发现，这支持了 sensor-helper 相互作用的“激活与释放”模型。此外，冷冻电镜分析还揭示了由两个NRC4六聚体形成的哑铃状十二聚体。类似的结构在果蝇的Dark（凋亡体中也有观察到，后者形成一个双层环状复合物。然而，最近的一项研究显示，激活的Dark形成一个单层、未封闭的环，具有信号传导能力。 4、TNL抗病小体 在植物免疫系统中，TNL RPP1和ROQ1一旦感知到其特异性病原效应子，便会迅速组装成抗病小体。RPP1和ROQ1的抗病小体在功能和机制上展现出诸多共性，尤为引人注目的是，它们在LRR结构域之后拥有一个新颖的C-JID结构域，专门负责识别病原效应子。效应子的识别触发了RPP1和ROQ1的结构重组。这两种TNL抗病小体的组装过程，涉及TIR结构域的自组装。与五聚体的CNL或六聚体的NRC抗性体不同，TNL抗性体呈现四聚体的形式。然而，涉及病原效应子诱导的构象变化的激活机制，在CNL和TNL中高度保守。 5、TNL激活NADase活性 TIR结构域作为进化上高度保守的免疫模块，广泛存在于多种生命形式之中。人类的SARM1展现出NADase活性，通过耗竭NAD+来诱导神经元细胞的死亡。植物中的TIR结构域亦具备类似的NADase活性。RPP1抗病小体的解析进一步证明了TIR的NADase活性。RPP1和ROQ1 抗病小体 的冷冻电镜结构显示，四聚体TIR结构域包含两个紧密排列的催化单元，每个催化单元由一个不对称的TIR二聚体构成。这种激活TIR NADase的机制在不同物种的TIR结构域蛋白中都是保守的。
尽管TNL和仅含TIR结构域的蛋白质共享相同的下游信号传导组分，但后者缺乏病原效应子感应结构域。那么，这些仅含TIR结构域的蛋白质的NADase活性是如何被激活的呢？最近的研究显示，NAD+和ATP诱导的凝聚作用能够激活这些仅含TIR结构域的蛋白质的NADase活性。例如，RBA1是拟南芥中的一种仅含TIR结构域的蛋白质，能够识别病原效应子HopBA1，从而触发HR细胞死亡。HopBA1显著诱导RBA1的表达及其凝聚，进而触发RBA1介导的HR细胞死亡。其他几种仅含TIR结构域的蛋白质也表现出类似的诱导凝聚现象，这表明它们的NADase活性激活机制是保守的。
6、NLR抗病小体信号殊途同归:Ca离子信号 ZAR1抗病小体中， 除了N端的α1螺旋外，CC结构域几乎完全被包裹 。暴露的α1-螺旋形成了一个漏斗状结构，具有疏水的外表面和带负电的内表面。这些结构数据传达了一种假设，即ZAR1抗病小体作为通道发挥作用。电生理学研究表明，该NLR抗病小体表现出阳离子选择性通道活性。ZAR1的α1螺旋包含一个‘MADA’基序，这一基序在NRC及多种单子叶和双子叶植物的CNL中高度保守。最近的研究还发现，非开花植物中的一个CC结构域亚家族中存在一个保守的‘MAEPL’基序，其功能与‘MADA’基序相似。这些发现表明，CC结构域的功能在进化过程中高度保守。尽管CNL抗病小体在寡聚状态上存在差异，但它们的CC结构域在这些抗病小体中排列整齐。NRG1和ADR1也能在质膜上形成抗病小体，并表现出钙离子通道活性。不同NLR激活一组保守的免疫反应，说明存在一个涉及钙信号传导的共享机制。 尽管NLR抗病小体在钙信号传导中汇聚，但它们之间存在机制上的差异。ZAR1抗性体中的α1形成一个锚定在质膜上的漏斗状结构，而Sr35、NRC2和NRC4抗性体由于α1的固有灵活性，缺乏类似的结构。与ZAR1不同，Sr35的钙离子通道活性不依赖于α1中的负电荷残基。α1中的疏水残基替换不影响NRC4与质膜的结合，但会消除细胞死亡活性。相比之下，Sr35中类似的替换会消除细胞死亡，但对质膜上的寡聚化影响不大。与ZAR1、MLAs和Tm-22不同，Sr35的细胞死亡活性对N-末端标签的存在不敏感。最近的一项研究表明，一些CNL的N-末端形成不同的结构，使这些抗病小体能够在不同的细胞器膜上积累。这些数据共同强调了CNL抗病小体在介导钙信号传导中的复杂性和多样性。 7、NLR抗病小体的信号传导机制 正如ZAR1触发的免疫反应所展示的，钙离子内流更可能作为触发因子而非直接执行者，启动效应子触发的免疫（ETI）。不同CNL抗病小体中保守的钙离子通道和细胞死亡活性，突显了钙离子内流作为ETI信号传导的一般触发因子的重要性。诸如钙调蛋白（CaM）、CAM样蛋白（CML）、钙调神经磷酸酶B样蛋白（CBL）、钙依赖性蛋白激酶（CPK）以及钙结合转录因子CBP60g和钙调蛋白结合转录激活因子3（CAMTA3）等钙结合蛋白，可以作为传感器，感知细胞质中钙离子水平的升高，从而介导ETI的信号传导。通常在钙离子内流之后发生的活性氧（ROS）爆发，与钙信号传导密切相关。钙信号可以通过直接结合EF hand结构域并由钙结合蛋白磷酸化，激活RBOHD，从而引发ROS的产生。细胞质钙离子水平的升高所引起的转录重编程，是ETI的一个重要下游反应。此外，CNL与WRKY等转录因子的相互作用可以介导转录重编程。然而，这些CNL的转录重编程活性是否需要抗病小体的组装，目前尚不清楚。
在拟南芥中，EDS1与PAD4和SAG101形成互斥的异二聚体。TNL激活诱导EDS1-PAD4和EDS1-SAG101分别与ADR1和NRG1的相互作用。最近的研究揭示，TNL抗病小体催化产生多种第二信使，包括pRib-AMP、pRib-ADP、ADPr-ATP和di-ADPR。pRib-AMP/ADP优先诱导EDS1-PAD4与ADR1的相互作用，而di-ADPR/ADPr-ATP则刺激EDS1-SAG101与NRG1的相互作用。这些第二信使可以激活ADR1和NRG1抗病小体及其钙离子通道活性，但其精确的分子机制尚待阐明。除了这些第二信使外，植物TNL抗性体还可以催化产生非典型的环状2’-cADPR。然而，这种小分子的生物学功能目前仍不清楚。
8、展望 NLR抗病小体的概念已在多项研究中逐步确立。钙信号被确认为效应子触发免疫（ETI）的主要触发因子，这对于深入解析NLR信号传导机制具有重要意义。然而，关于NLR信号传导的关键问题依然存在。其中，一个颇具挑战性的问题是鉴定连接抗病小体 与免疫反应的钙离子传感器。NLR抗病小体如何整合到质膜或内膜中，其具体机制尚不明确。尽管已有研究报道许多NLR定位于细胞核及其他亚细胞区域，但NLR在细胞核中的功能及其在ETI期间转录重编程中的潜在作用仍需进一步阐明。PTI与ETI均汇聚于钙信号的产生，但HR细胞死亡通常与ETI相关。进一步研究这一关联是否由钙通道的不同活性引起，将具有重要意义。相关的问题还包括NLR抗病小体不同通道活性的结构决定因子。许多NLR仍为孤儿受体，因为它们的潜在病原效应子尚未被鉴定。此外，NLR在维持宿主生理稳态中的潜在功能，亦值得深入探索。采用多学科方法对于解决这些问题、阐明调控NLR功能的复杂机制至关重要。随着我们对NLR的认识不断积累，利用基于AI的建模将NLR与其相应的病原效应子配对成为可能。该领域的持续研究对于设计具有新特异性的NLR和开发增强植物抗性的策略以提高农业生产力具有重要意义。
小麦族多组学网站： http://wheatomics.sdau.edu.cn
