原创解读 | PLoS Pathog | 新方法助力小麦白粉病无毒基因的高效鉴定

为了破解这一难题，近期的研究“Avirulence depletion assay: Combining R gene-mediated selection with bulk sequencing for rapid avirulence gene identification in wheat powdery mildew”提出了一种新方法——Avirulence Depletion Assay。该方法通过在抗性寄主上筛选单倍体白粉病分离株的F₁后代，并结合测序技术，实现了对小麦白粉病菌（Bgt）中无毒（AVR）基因的快速鉴定。实验结果显示，该方法不仅成功定位了已知的AVR基因AvrPm3a，还首次鉴定出了小麦Pm60基因的无毒基因AvrPm60。与传统方法相比，新方法显著缩短了鉴定周期并降低了成本，同时实现了候选基因的高精度鉴定。此外，该方法的快速鉴定能力有助于深入了解无毒基因与抗病基因之间的相互作用机制，这对于提高抗病基因的持久性以及实现抗病资源的有效区域部署具有至关重要意义。

主要研究内容

在本研究中，作者开发了一种新方法（Avirulence Depletion Assay），可快速鉴定Bgt中无毒基因。

1、通过新方法实现AvrPm3^a2/f2的高分辨率定位

根据图1所示的工作流程，新方法（Avirulence Depletion Assay）遵循双亲本定位的基本原理，但巧妙地避免了建立、维持定位群体以及对每个个体基因型进行详细测定的复杂过程。该方法的核心在于，通过杂交两个在含有R基因的小麦品种上展现出截然相反致病性的小麦白粉病菌亲本，直接生成了一个单倍体的F₁后代群体。与传统方法不同，新方法创造性地利用F₁后代的单倍体分生孢子直接感染抗性小麦，以此施加选择压力，从而有效地淘汰那些携带AVR基因的个体。同时，作为对照实验，F1后代也被感染到感病小麦上。随后，对在抗性小麦上存活下来的F1-2后代进行测序，利用单核苷酸多态性（SNP）来评估亲本基因型的比例。

在对照实验中，以及那些未受到R基因选择影响的区域，亲本基因型的比例保持为1:1。然而，在那些含有AVR基因的区域，无毒基因型的比例会显著减少。这种偏离1:1比例的现象，提供了确定候选AVR位点的关键线索。最终，结合基因组和转录组数据，能够精确地鉴定出AVR基因。

图1无毒基因（AVR）AD试验工作流程示意图

为验证新方法的有效性，作者首先以定位Bgt已知无毒基因AvrPm3^a2/f2为例。杂交分离株CHVD_042201和CHN_52_27获得F1后代；利用Pm3a近等基因系小麦和感病小麦对F1后代进行筛选；分别收集孢子并进行高深度二代测序。由于AvrPm3^a2/f2位点的序列复杂性，先前的研究并未完全解析该位点。因此，本研究利用PacBio HiFi技术近乎完整的组装了无毒亲本CHVD_042201基因组，并完全解析了AvrPm3^a2/f2位点及其他复杂区域。将二代测序数据比对到新组装的CHVD_042201基因组上，确定了198,027个高质量SNP作为遗传标记。在没有经历选择的对照群体中，未发现显著偏离1:1比例的区域；而在Pm3a选择群体中，Chr-06上一个包含AVRPm3^a2/f2基因的区域显著偏离。进一步分析发现，有毒亲本CHN_52_27中的AVRPm3^a2/f2变体（AVRPm3^a2/f2-B）具有三个氨基酸变化，被确认为毒性等位基因。

此外，作者还测试了新方法在使用CHE_96224作为参考基因组时的效果，同样成功鉴定了AVRPm3^a2/f2。这表明新方法是一种强大的工具，可用于鉴定Bgt中的无毒基因，且其有效性在不同参考基因组下均得到验证，进一步证实了新方法具有广泛的适用性。

图2 AVRPm3^a2/f2高分辨率定位以及功能验证

2、克隆小麦Pm60基因的无毒基因AvrPm60

作者运用新方法成功鉴定了与Pm60基因的无毒基因AvrPm60。通过对比分析在“科农199 Pm60”转基因品系上展现出相反致病性表型的两个白粉病菌（Bgt）亲本分离株CHVD_042201和CHN_52_27，作者揭示出AvrPm60的候选位点与先前鉴定的AVRPm3^a2/f2位点存在部分重叠。在Pm60选择的群体中，无毒等位基因耗竭信号最强的区域（即95%来自毒力亲本CHN_52_27的测序数据）覆盖了CHVD_042201中667kb的区域，该区域包含16个已注释的高质量基因，全部属于E008候选效应物家族。进一步筛查发现，这16个基因中有7个在亲本分离株间存在多态性，因此被视为AvrPm60的潜在候选基因。在这7个多态性基因中，只有4个基因携带单核苷酸多态性（SNP），导致毒力和无毒亲本之间的氨基酸多态性。对于其他3个基因（CHVD042201-04743、CHVD042201-04745和CHVD042201-04747），由于没有检测到来自CHN_52_27的测序数据，这表明这三个基因在毒力亲本中被删除。

图3 利用新方法对AvrPm60_1和AvrPm60_2进行定位和功能验证

有趣的是，这三个被删除的基因（CHVD042201-04743、CHVD042201-04745和CHVD042201-04747）是同一效应物基因的串联重复，位于无毒分离株CHVD_042201中一个7.7kb的重复片段内，且序列高度一致。其中，前两个基因编码的蛋白相同，而CHVD042201-04747有一个氨基酸差异（E103G）。这三个基因（编码两种几乎相同的蛋白AvrPm60_1和AvrPm60_2）能在烟草中与Pm60共表达时触发超敏反应（HR），且AvrPm60_2的HR反应更强，证明这三个基因就是AvrPm60。AvrPm60的结构特征，与已知的E008家族成员具有相似性，并且在感染早期阶段表现出高水平的表达。因此，AvrPm60被认为是白粉病菌RNAse-like效应子类别的一员。

3、AVRPm60缺失介导的毒性获得在全球罕见，却在美国白粉病菌中普遍存在

作者发现对Pm60具有毒性的分离株CHN_52_27因缺失包含所有三个AVRPm60拷贝的大片段，从而规避了Pm60介导的抗性。为了探究这种毒性增强机制在全球小麦白粉病菌（Bgt）群体中的频率和分布情况，基于382个公开的Bgt分离株重测序数据，作者估算了AvrPm60基因的拷贝数。结果发现，多数Bgt分离株含有两个AvrPm60拷贝，包括CHN_52_27在内的13个分离株完全缺失AvrPm60拷贝，其中仅一个来自中国，其余均源自美国约19%，约美国Bgt分离株的19%（表1）。

图4 AvrPm60拷贝数变异和Pm60等位变异的功能特征

后续作者通过实验验证与覆盖度分析结果证实了特定分离株中AvrPm60基因拷贝的缺失。毒性表型测定结果进一步显示，所有至少含有一个AvrPm60基因拷贝的分离株在Pm60转基因品系上均表现出无毒表型，而所有AvrPm60基因缺失的分离株则展现出完全毒性。因此，AvrPm60基因的缺失作为一种毒性增强机制，能够使Bgt克服Pm60介导的抗性，且在美国尤为普遍，这可能会限制Pm60在该地区的应用效果。

表1 来自不同地理区域的Bgt分离株中AvrPm60基因的估计拷贝数

4、Pm60及其等位基因Pm60a和Pm60b对AvrPm60_1和AvrPm60_2的识别效果有差异

Pm60抗性基因源自六倍体小麦A基因组的祖先乌拉尔图小麦（T. urartu）。在乌拉尔图小麦中，还发现了两个新的等位基因Pm60a和Pm60b，它们对小麦白粉病菌（Bgt）均有抗性。蛋白序列分析发现Pm60，Pm60a和Pm60b之间的差异主要是LRR重复数目不同。先前的研究表明，这三个等位基因（Pm60，Pm60a和Pm60b）对Bgt的识别谱有重叠，暗示它们可能识别同一无毒基因。为验证此假设，作者在烟草中共表达了这三个等位基因与Bgt的无毒基因AVRPm60_1和AVRPm60_2，结果显示均能诱导超敏反应（HR）。因此，三个Pm60等位基因均能特异性识别AVRPm60_1和AVRPm60_2。然而，不同等位基因与无毒效应蛋白组合诱导的HR强度有显著差异。尽管蛋白积累水平相似，但Pm60a和Pm60b在识别AvrPm60变体时HR强度较Pm60低。这表明LRR重复序列的拷贝数变异不影响识别特异性，但可能调节HR的强度。

5、总结与讨论
  在识别AvrPm60系列效应蛋白的能力上，Pm60优于Pm60a和Pm60b。这种优势归因于Pm60a和Pm60b在NLR蛋白内部分别缺失或重复了两个LRR重复序列，导致它们识别AVR基因的能力较弱。这一现象突出了NLR蛋白内部的多态性对其功能强度和AVR蛋白识别能力的影响，因此在小麦育种中应优先考虑利用具有更强识别能力的Pm60等位基因。除此之外，新方法在鉴定小麦病原体Bgt中的AVR基因方面展现出多重优势：

（1） 该方法利用Bgt的遗传作图优势，简化了繁琐的单个F1后代表征过程，将鉴定周期从传统的1-2年大幅缩短至4个月，显著提高了鉴定效率。

（2） 相较于传统方法，新方法大幅减少了测序的工作量，仅需对选定和未选定的F1-2代进行测序，从而降低了实验成本。

（3） 同时，该方法支持两种并行化鉴定方式，既可以在包含多个R基因的品系上选择相同后代群体，也可以同时产生来自不同遗传杂交的后代群体进行AVR基因分离。这种并行化策略进一步提升了AVR基因鉴定的速度和效率。

（4） 新方法不仅适用于典型AVR基因的鉴定，还特别适合于非典型AVR基因或R基因介导抗性抑制因子的鉴定，显示出广泛的适用性。

综上所述，新方法在鉴定小麦病原体Bgt中的AVR基因方面表现出高效、快速、低成本、并行化能力强以及广泛适用等多重优势，为小麦抗病育种提供了有力支持。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39775406/