【视频解读】甘肃农业大学杨敏教授等：酪蛋白-海藻酸钠基乳液凝胶性质及其在姜黄素负载中的应用

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姜黄素(curcumin,Cur)是一种天然酚类物质,具有极好的抗菌、抗氧化、降血脂等活性;Cur也是一种天然色素,在赋予食品鲜艳色泽的同时使食品具有一定的功能特性^[1-3]。然而,Cur稳定性差,难溶于水,且在中性至碱性条件下不稳定;Cur还是一种光敏性物质,在24 h强光照射下无水乙醇溶解的Cur可被完全降解,溶液由黄色转变为无色^[4]。经口摄入后,Cur在胃液及小肠液中溶解度低,小肠透过性低,导致其生物利用度极低^[5]。为了改善Cur的稳定性和生物利用度,已开发出多种稳态递送体系对其进行包埋和递送,如乳液、凝胶、微胶囊、脂质体等^[3]。

乳液凝胶是一种被油滴填充的具有凝胶网络结构的半固体体系,其包含乳液结构和凝胶特性,具有较强的力学性能、持水性和溶胀性。凭借良好的稳定特性,乳液凝胶在功能食品及医药领域具有广阔的应用前景,可以作为传递体系用来递送天然活性物质,以提高其稳定性^[6]。研究发现,辛烯基琥珀酸淀粉基Pickering乳液凝胶中的叶黄素保留率可以达到55.38%,半衰期从12 d延长至41 d^[7]。以海藻酸盐为基质制备的负载Cur的乳液填充微凝珠对Cur的包埋率高达99.15%,负载量达到7.25 mg/g^[8]。由此可见,乳液凝胶具有良好的活性分子封装和保护能力。

乳液凝胶常用基质为蛋白质和多糖,其中乳源蛋白质来源广泛、营养价值高,常被用作乳液凝胶基质。酪蛋白(casein,CN)是乳中含量最高的蛋白质,约占牛乳中蛋白质含量的80%^[9]。CN不仅营养价值高,还具有优良的表面活性、凝胶性和自组装性能。另外,CN还具有较高的活性分子亲和性、低毒性和良好的生物相容性,可作为营养因子载体,以提高其稳定性和生物利用度^[10]。研究指出,CN对Cur的结合常数高达9.2×10³ L/mol,经CN负载后Cur对MCF-7乳腺癌细胞的抑制效果显著提升^[11]。自组装的CN对Cur的包封率高达97%,经CN负载有效减缓了Cur在高温和光照环境下的降解速率^[12]。可见,CN是Cur的优良载体。

因良好的乳化性和凝胶性,CN常被作为乳液凝胶基质。传统CN基乳液凝胶制备工艺包括乳化、凝胶化,即用CN乳化油相形成初级乳液,再通过酸、酶、热等处理诱导CN形成凝胶。传统制备工艺复杂,成本高^[13-14]。本团队前期以酪蛋白胶束为基质,经一步均质法制备了乳液凝胶,不仅简化了乳液凝胶制备工艺,而且通过添加海藻酸钠(sodium alginate,SA)显著提升了乳液凝胶的贮藏稳定性;将该乳液凝胶用于负载原花青素和咖啡酸苯乙酯,发现其对结肠癌细胞的抑制率显著提升^[15]。虽然CN与酪蛋白胶束组成相似,但其结构具有明显差异。酪蛋白胶束为直径50～500 nm的近球形胶体粒子,而CN为线性柔性结构^[16]。CN是否与酪蛋白胶束一样可经一步均质法制备乳液凝胶尚不清楚,且CN基乳液凝胶负载Cur的研究鲜为报道。

本研究拟以CN、SA为基质,希望经一步均质法制备油相体积分数为80%的乳液凝胶,并用于负载Cur;探究CN与SA体积比对乳液凝胶微观结构、理化性质及稳定性的影响规律;分析经CN-SA基乳液凝胶负载后Cur的模拟胃肠消化释放特性。研究结果旨在为CN-SA基乳液凝胶体系构建及其在负载、递送Cur方面的应用提供参考依据。

1.1 材料与试剂

将巴氏灭菌乳(购自兰州庄园牧场股份有限公司)于4 000 r/min离心30 min进行脱脂,收集脱脂乳并调pH值至4.6沉淀CN。收集沉淀后冷冻干燥制得酸沉淀CN,4 ℃冷藏备用^[17]。经测定,CN中蛋白质质量分数为95.76%±0.78%。

金龙鱼大豆油,益海嘉里粮油食品股份有限公司;海藻酸钠(SA)、姜黄素(Cur)、叶绿素铜钠、胃蛋白酶(15 000 U/g)、胰蛋白酶(>2 500 U/mg),上海麦克林生化科技有限公司。实验所用试剂均为分析纯。模拟胃液,含有2 g/L NaCl、3.2 g/L胃蛋白酶;模拟肠液,含有6.8 g/L磷酸二氢钾、10 g/L胰蛋白酶、12 g/L猪胆盐,pH值为7.5。

1.2 仪器与设备

FD-1-50型真空冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司;AD500S-H型均质机,上海昂尼仪器仪表有限公司;N-180M型光学显微镜,河南兄弟仪器设备有限公司;BXT-SH82型恒温水浴振荡器,上海能共实业有限公司;XH-T型X射线多晶衍射仪,北京普析通用仪器有限责任公司;H1850型台式高速离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;UV-1780型双光束紫外可见分光光度计,岛津仪器有限公司;Nicolet iS50型傅里叶变换红外光谱仪,美国赛默飞世尔科学公司;STA449F5型同步热分析仪,德国耐驰仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 CN-SA复合物的制备

将CN分散于去离子水中,用NaOH(1 mol/L)将溶液pH值调至7.0,于37 ℃恒温水浴中磁力搅拌2 h并保持pH值恒定为7.0,确保CN完全溶解,制得质量分数为4%的CN溶液。将SA分散于去离子水中,于37 ℃磁力搅拌至完全溶解,制得质量分数为2%的SA溶液,放置过夜。随后,将CN和SA溶液按照体积比为10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5的比例混合,混合液于37 ℃磁力搅拌2 h,制得CN-SA复合物。

1.3.2 CN-SA基乳液凝胶的制备

将姜黄素(Cur)分散至大豆油中,50 ℃下水浴加热搅拌至完全溶解,终浓度为0.05 mmol/L。取制备的CN-SA复合物溶液6 mL加入24 mL溶解了Cur的大豆油中,并于14 000 r/min均质3 min,制得油相体积分数为80%的CN-SA基乳液凝胶,分别记作G-CN-Cur、G-CN-SA(9∶1)-Cur、G-CN-SA(8∶2)-Cur、G-CN-SA(7∶3)-Cur、G-CN-SA(6∶4)-Cur、G-CN-SA(5∶5)-Cur。以单一CN基质和不含Cur的乳液凝胶为对照,记作G-CN。

1.3.3 乳液凝胶微观结构观察

采用光学显微镜(物镜40×、目镜10×)对乳液凝胶的微观结构进行观察。

1.3.4 乳液凝胶FTIR测定

参照Qin等^[18]的方法,将少量CN-SA乳液凝胶置于衰减全反射(attenuated total reflection,ATR)元件,采集红外光谱,扫描范围4 000～400 cm^-1,仪器分辨率为2 cm^-1。

1.3.5 乳液凝胶X-射线衍射谱的测定

将乳液凝胶样品用X-射线多晶衍射仪在Cu的Kα射线下进行扫描,测定样品的X-射线衍射(XRD)光谱。

1.3.6 乳液凝胶色度测定

参照前期研究方法^[19],使用精密色差仪测定CN-SA乳液凝胶的色度。室温下对色差仪进行校准,取适量测试样品铺平,将色差仪的测试口与被测样品紧密贴合,保持稳定且不漏光,测定颜色数据并进行记录。样品色差ΔE计算方法见式(1)。

(1)

式(1)中:为游离Cur的色值;a^*、b^*、L^*为乳液凝胶的色值。

1.3.7 乳液凝胶稳定性测定

1.3.7.1 贮藏稳定性测定

取3 mL新鲜制备的乳液凝胶置于5 mL小玻璃瓶中并于4 ℃冰箱贮藏,动态观察乳液凝胶外观状态并拍照记录,在光学显微镜下观察其微观结构。

1.3.7.2 冻融稳定性测定

参照冯潇等^[20]的方法,取2 mL新鲜制备的乳液凝胶置于小玻璃瓶中,于-20 ℃下冷冻4 h后取出,并于室温下解冻1 h,观察油析情况并拍照记录。重复上述操作2～3次,观察乳液凝胶的表观状态并拍照记录。

1.3.7.3 稀释稳定性测定

取2 mL新鲜制备的乳液凝胶置于小玻璃瓶中,向其中分别加入3 mL不同pH值(1.5、4.5和7.5)的水溶液,涡旋混合1 min,于室温下观察乳液凝胶表观状态并拍照记录。

1.3.7.4 热稳定性测定

参照Qin等^[15]的方法,采用热重-差示扫描量热仪进行分析;称取乳液凝胶样品13～15 mg,置于氧化铝坩埚中,以空坩埚作为对照;测试温度为 25～500 ℃,升温速率为5 ℃/min。

热稳定性测定:取2 mL乳液凝胶样品置于小玻璃瓶中,分别于65、85 ℃水浴中加热1 h,待其自然冷却至室温后观察表观状态及微观结构。

1.3.7.5 离心稳定性及水合性测定

将制备的乳液凝胶于4 000 r/min离心20 min,出现上层凝胶相和下层清液相;向清液相中加入一定量的叶绿素铜钠溶液,再于14 000 r/min均质3 min,观察颜色分布和油析情况,并拍照记录。

水合性计算方法见式(2)。

水合性

(2)

式(2)中:m₁为离心前乳液凝胶的质量,g;m₂为离心并弃去底部清液后剩余乳液凝胶的质量,g。

1.3.8 乳液凝胶的体外模拟消化评价

参考王楠等^[21]的方法,在截留分子质量为1 kDa的透析袋中放入1 g乳液凝胶,加入3 mL pH值为1.2的模拟胃液(SGF)。将透析袋置于装有150 mL由等体积50%乙醇和无酶模拟胃液组成的释放介质中,于37 ℃、100 r/min下振荡反应2 h;每隔30 min取3 mL透析液,并补充3 mL释放介质。

向透析袋中加入3 mL模拟肠液(SIF),然后将透析袋置于150 mL的50%乙醇和无酶模拟肠液的释放介质中,在水浴恒温振荡器37 ℃、100 r/min下振荡反应8 h,每隔1 h收集3 mL透析液,并补充3 mL释放介质,以保持体积恒定。采用紫外可见分光光度计在430 nm下测定透析液的吸光值,以同一释放介质中绘制的Cur标准曲线为依据计算其浓度,进而计算释放率。计算方法见式(3)。

Cur释放率

(3)

式(3)中:m_初始为初始乳液凝胶中Cur的质量,g;m_释放为消化过程中释放的Cur质量,g。

按照1.3.8的消化方法,将乳液凝胶置于试管中进行消化,并参照Yang等^[22]的方法在设定时间点将消化物以4 000 r/min离心20 min,收集中间清液相。将1 mL清液与4 mL无水乙醇充分混合,4 000 r/min离心20 min后收集上清液,采用紫外可见分光光度计在430 nm下测定吸光度,通过Cur标准曲线计算其浓度,采用式(4)计算Cur的生物可给率。

生物可给率

(4)

式(4)中:c_初始为初始乳液凝胶中Cur的浓度,mol/L;c_清液相为离心后上清液中Cur的浓度,mol/L。

1.4 数据处理

所有实验重复3次,数据采用Excel 2010软件处理并用平均值±标准偏差表示,用Origin Pro 9.0软件绘图,用IBM SPSS Statistics 22软件进行差异显著性分析,数据间差异显著分析采用Duncan法,以P<0.05表示显著性差异。

2.1 CN-SA基乳液凝胶的表观状态及微观结构分析

CN基乳液凝胶及CN与SA不同体积比时负载Cur的乳液凝胶表观状态如图1。由图1可知,CN基乳液凝胶和CN与SA体积比为9∶1至7∶3时的乳液凝胶质地均匀且倒置时不流动,表明其形成了半固体状凝胶。CN具有一定的乳化性,有助于乳液的形成;当油相体积分数足够大时,乳化的油滴紧密排列,形成半固体状凝胶^[23]。加入适量SA,乳液凝胶的状态未被破坏。然而,当CN与SA体积比为6∶4和5∶5时,样品在正置时分成两相,倒置时可流动,并观察到玻璃瓶内壁上有酪蛋白聚集体。这是由于SA乳化性较差,CN添加量过少不足以乳化油相;另一方面,实验所用SA浓度低于CN,随着SA体积的增大,基质中大分子数量减少,油滴间隙过大,未能形成拥堵状态,从而未形成凝胶。本团队前期研究发现,酪蛋白胶束与果胶/海藻酸钠在体积比为 10∶0 至7∶3范围内可成功制备油相体积分数为70%的乳液凝胶^[15]。本研究结果表明,用CN替换酪蛋白胶束后,可在相同条件下制备油相体积分数为80%的乳液凝胶,油相含量明显提升。可见,CN可以作为基质,通过一步均质法制备高内相乳液凝胶。

A、B、C、D、E、F、G分别为G-CN、G-CN-Cur、G-CN-SA(9∶1)-Cur、G-CN-SA(8∶2)-Cur、G-CN-SA(7∶3)-Cur、G-CN-SA(6∶4)-Cur、G-CN-SA(5∶5)-Cur。

图1 CN基乳液凝胶及负载Cur的CN-SA基乳液凝胶的外观

Fig.1 Appearance of emulsion gels based on CN or CN-SA loading Cur

CN-SA基乳液凝胶的微观结构如图2。由图2可知,乳液凝胶中油滴分布较为均匀,且相互拥挤,具有O/W型结构。未负载Cur的CN基乳液凝胶油滴平均粒径最大,为(107.00±7.45) μm。负载Cur的乳液凝胶油滴平均粒径随着SA添加量的增大而减小,由未添加SA的(86.00±6.31) μm减至(47.00±0.97) μm。乳液凝胶基质的Zeta电位测定结果如图3。由图3可知,SA和CN溶液在中性条件下均带负电荷,其不同体积比的复合物也带负电荷。相较于CN溶液,CN-SA混合液的Zeta电位绝对值更大,说明SA的加入使CN结构发生变化,其带电基团充分暴露,SA与CN间静电斥力增加^[24]。因此,添加SA后,乳液凝胶中SA与CN之间的静电作用使乳化的油滴间具有一定的斥力,从而粒径减小,且其减小程度随SA添加量的增加而增大。有研究指出,油滴平均粒径减小可缩短油滴间的距离,使油滴间相互作用增加,从而增加乳液的稳定性^[25]。由此推断,适量添加SA可提升CN基乳液凝胶的稳定性。

横坐标为乳液凝胶的油滴粒径分布区间,纵坐标为该粒径分布区间内油滴的数目,图中数值为所统计区间内所有粒径的平均值,标尺为600 μm。

图2 CN基乳液凝胶及负载Cur的CN-SA基乳液凝胶微观结构及油滴粒径分布

Fig.2 Microstructure and size distribution of oil droplets of emulsion gels based on CN or CN-SA loading Cur

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图3 CN-SA基乳液凝胶基质的Zeta电位

Fig.3 Zeta potential of CN-SA emulsion gels

2.2 CN-SA基乳液凝胶的红外光谱分析

不同CN与SA体积比时CN-SA复合物和负载Cur的乳液凝胶红外光谱见图4。由图4(a)可知,游离SA在1 636 cm^-1处的特征吸收峰为CO的伸缩振动^[26];CN在1 636 cm^-1处为CO伸缩振动峰,即酰胺Ⅰ带^[27]。形成复合物后,随着SA含量的增加,酰胺Ⅰ带的透过率略有降低,但波数没有发生明显偏移,说明CN与SA产生了物理相互作用,即静电斥力,但不显著影响CN的空间结构^[28]。并且CN-SA复合物没有出现新的特征峰,说明二者之间为物理相互作用,没有产生新的化学键。

图4 CN-SA复合物及CN基乳液凝胶、负载Cur的CN-SA基乳液凝胶的红外光谱

Fig.4 FTIR spectra of CN-SA complexes and emulsion gels based on CN or CN-SA loading Cur

Cur有多个特征衍射峰,其中1 000～1 300 cm^-1处的吸收峰对应C—O—C链振动,1 450～1 630 cm^-1是CO和CC的混合吸收峰^[29]。由图4(b)可知,与CN-SA复合物的红外光谱对比,制备成凝胶后,1 636 cm^-1处的峰移动到1 644 cm^-1处,说明由于受到Cur中—CO、—OH的影响,加上油相的作用,蛋白质的空间结构可能发生了变化^[30]。与CN和游离SA相比,CN基乳液凝胶及CN与SA不同体积比时负载Cur的乳液凝胶中没有出现新的吸收峰,并且负载Cur的乳液凝胶中Cur特征峰消失,证实其被包埋在凝胶内部。

2.3 CN-SA基乳液凝胶的XRD谱图分析

CN基乳液凝胶及不同CN与SA体积比时负载Cur的乳液凝胶XRD如图5。由图5可以看出,CN、SA为大分子,没有特征衍射峰,与文献报道一致^[31]。CN-SA复合物制备成乳液凝胶后,衍射峰有轻微偏移,但依然表现为大分子特征。Cur在2θ为12°～29°时出现多个强而尖锐的衍射峰,其中2θ在17.46°处表现出明显特征峰,说明Cur具有高度结晶的特性^[32]。此外,所有乳液凝胶的衍射谱图中均未出现Cur特征峰,表明Cur被包裹在乳液凝胶中^[33],再次证实了乳液凝胶的水包油结构。所有乳液凝胶的XRD谱图类似,这表明其微观结构相似,与红外光谱分析结果一致。

图5 CN基乳液凝胶和负载Cur的CN-SA基乳液凝胶及其基质的XRD谱

Fig.5 XRD patterns of emulsion gels based on CN or CN-SA loading Cur and their matries

2.4 CN-SA基乳液凝胶的色度分析

CN基乳液凝胶及不同CN与SA体积比时负载Cur的乳液凝胶及其基质色度测定结果见表1。由表1可知,不同比例CN-SA基乳液凝胶的L^*、a^*以及b^*值差异显著(P<0.05)。与未添加SA的乳液凝胶相比,随着SA添加量的增加,乳液凝胶的L^*、a^*、b^*值增大,由此可见,SA的添加提高了负载Cur的乳液凝胶的亮度,增大了其红色度和黄色度,且黄色度更加接近游离Cur。这是由于与CN相比,SA的透明度更高,L^*值更小,使得乳液凝胶中Cur的颜色更为突出。也就是说,CN-SA基乳液凝胶负载的Cur可基本保持其原有的色泽,不同小写字母表示同列数据差异显著(P<0.05)。CN、SA、G-CN样品颜色相近。“-”表示Cur、CN、SA、G-CN样品间无色差。

表1 CN基乳液凝胶和负载Cur的CN-SA基乳液凝胶及其基质的色度

Tab.1 Chromaticity of emulsion gels based on CN or CN-SA loading Cur and their matrices

且具有更好的亮度,完全可以满足不同食品对色泽的需要。

2.5 CN-SA基乳液凝胶的稳定性分析

2.5.1 贮藏稳定性分析

CN基乳液凝胶及不同CN与SA体积比时负载Cur的乳液凝胶在4 ℃贮藏0～750 d的外观如图6。由图6可知,贮藏15 d后,负载和未负载Cur的CN基乳液凝胶均出现分层现象,倒置时流动,而添加SA的乳液凝胶无明显变化。贮藏750 d后,添加SA的乳液凝胶依然保持凝胶状态,无明显油相析出。根据Hamaker理论,乳液油滴粒径越小,其稳定性越好^[34]。由图2可知,添加SA之后,乳液凝胶油滴粒径减小,因此CN-SA基乳液凝胶稳定性高于CN基乳液凝胶。另外,由于SA带有较高的负电荷,其与CN之间形成的静电斥力使乳液凝胶的稳定性提升,且SA添加量越大,静电斥力越大。因此,CN-SA基乳液凝胶具有较高的贮藏稳定性。本研究制备的乳液凝胶贮藏稳定性远高于魔芋葡甘露聚糖与CN形成的乳液,文献报道中此乳液在贮藏32 d时出现相分离现象^[35]。

A、B、C、D、E分别为G-CN、G-CN-Cur、G-CN-SA(9∶1)-Cur、G-CN-SA(8∶2)-Cur、G-CN-SA(7∶3)-Cur。

图6 不同贮藏期CN基乳液凝胶及负载Cur的CN-SA基乳液凝胶表观状态

Fig.6 Appearance of emulsion gels based on CN or CN-SA loading Cur during different storage periods

2.5.2 冻融稳定性分析

CN基乳液凝胶及不同CN与SA体积比时负载Cur的乳液凝胶在-20 ℃时冻融循环1～3次的外观如图7。由图7可知,经1次冷冻-解冻循环后,不同比例的CN-SA基乳液凝胶均出现相分离和油相析出,说明冷冻破坏了凝胶网络结构,使得乳液凝胶中的油相合并析出,与基质发生了相分离。重复冷冻-解冻循环2～3次后,乳液凝胶的油相和水相的分离更为明显,说明反复冻融可导致CN-SA基乳液凝胶的油水两相分离,也证明乳液凝胶冻融稳定性较差。冷冻-解冻过程中,CN和SA的结构在冰晶形成和融化的循环中被破坏,导致乳液凝胶质构和内部水分分布发生变化,从而使得油相合并析出^[36]。尽管CN-SA基乳液凝胶冻融稳定性较差,但可通过多次冻融实现乳液凝胶中油相的提取和分离。

A、B、C、D、E分别为G-CN、G-CN-Cur、G-CN-SA(9∶1)-Cur、G-CN-SA(8∶2)-Cur、G-CN-SA(7∶3)-Cur。

图7 CN基乳液凝胶及负载Cur的CN-SA基乳液凝胶冻融外观

Fig.7 Appearance of emulsion gels based on CN or CN-SA loading Cur after freeze-thaw

2.5.3 稀释稳定性分析

CN基乳液凝胶及不同CN与SA体积比时负载Cur的乳液凝胶经不同pH值水溶液稀释后放置7 d时的外观如图8。由图8可以看出,经不同pH值的水溶液稀释后,负载和未负载Cur的CN基乳液凝胶清液具有一定程度的浑浊。在pH值为1.5的条件下稀释,CN基乳液凝胶中有部分蛋白质析出,溶解于水相;添加SA的乳液凝胶较为稳定,未见蛋白和油相析出。当采用pH值为1.5的水溶液稀释时,吸附在油滴表面的CN所带电荷迅速由负电转变为正电,拥挤的油滴来不及合并,依然被CN包覆,因此CN基乳液凝胶未出现相分离。在pH值为4.5的条件下稀释,CN基乳液凝胶有少量油相析出,添加了SA的乳液凝胶未发生油相析出。就CN基乳液凝胶而言,pH值为4.5时,CN基本达到等电点,其所带电荷被中和,从而产生沉淀,因此乳液凝胶结构被破坏,出现油析现象。然而,加入SA之后,在酸的作用下填充在油滴间的SA所带电荷迅速由负电转为正电,与乳化油滴表面的CN产生静电引力而吸附在油滴表面,从而继续稳定了油滴,因此乳液凝胶未发生油析^[23]。pH值为7.5时,未吸附在油滴表面的CN在稀释下分散于稀释液,但乳化的油滴依然稳定。

A、B、C、D、E分别为G-CN、G-CN-Cur、G-CN-SA(9∶1)-Cur、G-CN-SA(8∶2)-Cur、G-CN-SA(7∶3)-Cur。

图8 CN基乳液凝胶及负载Cur的CN-SA基乳液凝胶在不同pH值溶液中保存7 d后的外观

Fig.8 Appearance of emulsion gels based on CN or CN-SA loading Cur in solutions with different pH after 7 d storage

CN基乳液凝胶及不同CN与SA体积比时负载Cur的乳液凝胶经不同pH值水溶液稀释后放置7 d时的光学显微观察结果及油滴粒径分布如图9。由图9可以看出,经过不同pH值的溶液稀释后,乳液凝胶的油滴仍然分散均匀,未出现明显油滴合并,证实了在不同pH值水溶液稀释下CN-SA基乳液凝胶仍保持结构完好,具有较高的稳定性。

横坐标为乳液凝胶的油滴粒径分布区间,纵坐标为该粒径分布区间内油滴的数目,图中数值为所统计区间内所有粒径的平均值,标尺为600 μm。

图9 CN基乳液凝胶及负载Cur的CN-SA基乳液凝胶在不同pH值的溶液中保存7 d后的微观结构及油滴粒径分布

Fig.9 Microstructure and size distribution of oil droplet of emulsion gels based on CN or CN-SA loading Cur solutions with different pH after 7 d storage

2.5.4 热稳定性分析

2.5.4.1 热分解特性分析

CN基乳液凝胶及不同CN与SA体积比时负载Cur的乳液凝胶差示扫描量热曲线(DSC)和热重曲线(TG)如图10。由图10(a)可知,SA在239 ℃出现放热峰,与文献报道一致^[37]。CN的DSC曲线呈现典型的蛋白质热解特征^[38]。Cur的DSC曲线在180 ℃有一个晶体熔融峰,表明其以晶体形式存在,与图5的XRD分析结果一致。负载Cur的乳液凝胶DSC图谱中没有出现Cur的晶体熔融峰,说明Cur被包封在乳液凝胶油相中。所有样品在90～130 ℃都有一个较宽的吸热峰,且随着SA添加量的增加,峰面积有所增大,这是由于SA溶液较CN溶液含水量高,而该处的吸热峰与结合水的蒸发有关。当温度升高至400～500 ℃,大豆油开始汽化和分解,凝胶的热流有上升趋势^[39]。由于乳液凝胶中80%为油相,因此所有乳液凝胶样品曲线均在400～500 ℃处产生吸热峰。

图10 CN基乳液凝胶及负载Cur的CN-SA基乳液凝胶的DSC和TG

Fig.10 DSC and TG of emulsion gels based on CN or CN-SA loading Cur

由图10(b)可以看出,CN和SA具有不同的质量损失特性,而乳液凝胶的TG曲线较为相似。CN和SA第一失重阶段在70～100 ℃,为水分蒸发阶段。SA的第二失重阶段出现在200～250 ℃,CN的第二失重阶段为200～350 ℃,可见CN热稳定性高于SA。乳液凝胶的失重曲线相似,说明各乳液凝胶微观结构相似。乳液凝胶的第一失重阶段出现在70～100 ℃,是由于水分的蒸发所导致。随着SA添加量的增加,第一阶段失重率增大,这是因为SA比CN的浓度低,水分含量增加,因此随着SA添加量的增加,水分汽化引起的失重率增大。当温度升高至350 ℃以上,大豆油开始汽化和分解,CN和SA也开始分解,此时凝胶质量迅速降低。温度高于450 ℃之后,质量损失速度减缓,剩余残渣碳化,这与本团队前期研究结果一致^[39]。因此,Cur被包封在乳液凝胶中且CN-SA基乳液凝胶具有较高的热稳定性。

2.5.4.2 热稳定性分析

CN基乳液凝胶及不同CN与SA体积比时负载Cur的乳液凝胶经不同温度热处理后的外观如图11。由图11可知,经热处理后的CN-SA乳液凝胶并未出现相分离或油相析出的现象,其油滴尺寸未发生显著变化,且倒置后不流动,证明热处理并没有破坏凝胶的网状结构。研究指出,向蛋白质中添加多糖可以提高凝胶稳定性^[40]。在加入SA后,由于静电斥力的作用,加上SA特有的黏性,阻碍了油滴运动,进一步降低了油相析出的可能性,提高了乳液凝胶的稳定性。所以,CN-SA基乳液凝胶具有较好的热加工稳定性。

A、B、C、D、E分别为G-CN、G-CN-Cur、G-CN-SA(9∶1)-Cur、G-CN-SA(8∶2)-Cur、G-CN-SA(7∶3)-Cur。

图11 不同温度热处理后CN基乳液凝胶及负载Cur的CN-SA基乳液凝胶外观

Fig.11 Appearance of emulsion gels based on CN or CN-SA loading Cur after heat treatment at different temperatures

CN基乳液凝胶及不同CN与SA体积比时负载Cur的乳液凝胶经不同温度热处理后的光学显微观察及油滴粒径分布如图12。由图12可知,同一样品经过不同温度热处理后油滴粒径不同,其中,65 ℃处理的样品油滴粒径小于85 ℃处理的样品油滴粒径。这是因为当温度达到85 ℃时,CN可能发生热聚集,部分小油滴合并,导致粒径增大^[41]。

横坐标为乳液凝胶的油滴粒径分布区间,纵坐标为该粒径分布区间内油滴的数目,图中数值为所统计区间内所有粒径的平均值,标尺为600 μm。

图12 不同温度热处理后CN基乳液凝胶及负载Cur的CN-SA基乳液凝胶微观结构及油滴粒径分布

Fig.12 Microstructure and size distribution of oil droplets of emulsion gels based on CN or CN-SA loading Cur after heat treatment at different temperatures

2.5.5 离心稳定性分析

CN基乳液凝胶及不同CN与SA体积比时负载Cur的乳液凝胶经离心和二次均质后的外观如图13。由图13可知,CN-SA基乳液凝胶进行高速离心后,分为凝胶相和水相,说明乳液凝胶具有一定的水合性。为了研究CN-SA基乳液凝胶的微观结构是否被破坏,在离心后的水相中加入一滴叶绿素铜钠溶液,再次均质后观察到均匀的绿色乳液凝胶,说明离心时乳液凝胶内部油滴分布结构并未遭到破坏,而再次均质将析出的水相又均匀分布到油滴间隙。CN基乳液凝胶及不同CN与SA体积比时负载Cur的乳液凝胶经离心和二次均质后的光学显微观察及油滴粒径分布如图14。由图14可以看出,二次均质后,未添加SA的乳液凝胶出现少量油滴合并现象,而CN-SA基乳液凝胶离心后油滴仍然分布均匀,且处于拥挤和堵塞状态。因此,离心和再次均质并没有引起CN-SA基乳液凝胶中油滴的合并,不破坏凝胶网络结构。由此可见,CN-SA基乳液凝胶具有较高的离心稳定性,可通过离心和再次均质将多种活性分子负载于水相中。

A、B、C、D、E分别为G-CN、G-CN-Cur、G-CN-SA(9∶1)-Cur、G-CN-SA(8∶2)-Cur、G-CN-SA(7∶3)-Cur。

图13 CN基乳液凝胶及负载Cur的CN-SA基乳液凝胶离心和二次均质后的外观

Fig.13 Appearance of emulsion gels based on CN or CN-SA loading Cur after centrifugation and secondary homogenization

横坐标为乳液凝胶的油滴粒径分布区间,纵坐标为该粒径分布区间内油滴的数目,图中数值为所统计区间内所有粒径的平均值,标尺为600 μm。

图14 CN基乳液凝胶及负载Cur的CN-SA基乳液凝胶离心和二次均质后的微观结构及油滴粒径分布

Fig.14 Microstructure and particle size distribution of emulsion gels based on CN or CN-SA loading Cur after centrifugation and homogenization

CN基乳液凝胶及不同CN与SA体积比时负载Cur的乳液凝胶水合性如图15。由图15可以看出,SA的加入显著提高了乳液凝胶的水合性(P<0.05),其中CN与SA体积比为7∶3时乳液凝胶水合性最高。这是因为SA具有较高的毛细管力和黏度,其对水分的吸附能力较强。本团队前期研究发现,随着SA或果胶添加量的增加,酪蛋白胶束基乳液凝胶的水合性增大^[15]。可见,SA的添加增大了乳液凝胶的水合性。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图15 CN基乳液凝胶及负载Cur的CN-SA基乳液凝胶水合性

Fig.15 Water holding capacity of emulsion gels based on CN or CN-SA loading Cur

2.6 CN-SA基乳液凝胶的模拟消化性分析

模拟胃肠条件下,不同CN与SA体积比时负载Cur的乳液凝胶中Cur的释放率和生物可给率分析结果如图16。由图16(a)可知,在模拟胃液消化过程中,乳液凝胶中Cur的释放率与游离Cur释放率较为接近。在模拟肠液消化过程中,乳液凝胶中Cur的释放率远高于游离Cur。这是因为乳液凝胶中Cur分散性较好,溶解性增大,更易于扩散,而游离Cur溶解性差,在肠液中难以分散,其扩散速率较低。另一方面,Cur在肠液环境中不稳定,部分发生降解,致使释放率降低^[42]。随着SA添加量的增大,Cur释放率增加。在CN与SA体积比为9∶1的乳液凝胶中,Cur在10 h的累积释放率为37.91%±1.91%;CN与SA体积比为8∶2时,累积释放率为46.67%±2.92%;在CN与SA体积比为7∶3时,累计释放率为53.59%±4.76%。这是由于SA与CN之间产生静电斥力,且SA浓度较CN低,因而随着SA添加量的增大,凝胶网络结构中空隙变大,液滴尺寸变小,更有利于酶的水解和Cur的扩散^[43]。因此,Cur的释放速率随着SA添加量的增加而增大。

不同小写字母表示所有样品间差异显著(P<0.05),不同大写字母表示乳液凝胶间差异显著(P<0.05)。

图16 模拟胃肠消化过程中负载Cur的CN-SA基乳液凝胶中Cur的释放率和生物可给率

Fig.16 Release profiles and bioaccessibility of Cur from emulsion gels based on CN-SA loading Cur during simulated gastrointestinal digestion process

由图16(b)的生物可给率分析结果可知,游离Cur的生物可给率极低,与文献报道一致^[44]。经乳液凝胶负载后,Cur的生物可给率显著增大(P<0.05)。随消化时间的延长,乳液凝胶中Cur的生物可给率增大。同一消化时间下,Cur的生物可给率随着SA添加量的增加而增大,即经CN与SA体积比为7∶3的乳液凝胶负载后,Cur的生物可给率最高,这是由于其在模拟胃肠液消化过程中Cur的释放率最高。

模拟胃肠消化过程中,不同CN与SA体积比时负载Cur的乳液凝胶外观如图17。由图17可以看出,模拟胃液消化2 h后,未观察到乳液凝胶相分离现象。胃液消化样品的显微观察结果如图18,由图18可以看出油滴保持完好。累积消化6 h后,所有乳液凝胶都出现油相析出的现象,CN分散于模拟消化液中,说明乳液凝胶结构被破坏;累积消化10 h后,模拟消化液浑浊现象更加明显,其中CN与SA体积比为7∶3的乳液凝胶最浑浊。可见,乳液凝胶在胃液中具有较高的稳定性,在肠液中有油相析出,有利于Cur的释放。CN基乳液凝胶负载有利于保护Cur不在胃液中释放,添加SA有利于提高CN基乳液凝胶中Cur的释放率和生物可给率,当CN与SA体积比为7∶3时效果最佳。

B、C、D、E分别为G-CN-Cur、G-CN-SA(9∶1)-Cur、G-CN-SA(8∶2)-Cur、G-CN-SA(7∶3)-Cur。

图17 模拟胃肠消化过程中负载Cur的CN-SA基乳液凝胶外观

Fig.17 Appearance of emulsion gels based on CN-SA loading Cur after simulated gastrointestinal digestion

图18 模拟胃液消化过程中负载Cur的CN-SA基乳液凝胶的微观结构

Fig.18 Microstructure during simulated gastric digestion of emulsion gels based on CN-SA loading Cur

以不同比例的CN和SA为基质,通过一步均质法制备了含油量为80%(体积分数)的乳液凝胶,发现当CN和SA体积比为9∶1至7∶3时,可形成乳液凝胶,用于负载Cur。负载Cur的乳液凝胶油滴粒径随SA添加量的增大而减小,由未添加SA的(86.00±6.31) μm减至(47.00±0.97) μm。添加SA后,乳液凝胶贮藏稳定性显著提升,其在贮藏750 d后仍然保持结构稳定。红外光谱和X射线衍射图谱显示,不同CN与SA体积比的乳液凝胶具有相似的结构。然而,乳液凝胶冻融稳定性较差,冻融3次后大量油相析出。SA的添加显著提升了乳液凝胶在不同pH值水溶液稀释下的稳定性。CN-SA基乳液凝胶具有较高的热稳定性和离心稳定性,其水合性随SA添加量的增加而增大。经CN-SA基乳液凝胶负载后,Cur在模拟肠液消化过程中的累积释放率和生物可给率显著提升,其中CN与SA体积比为 7∶3 时,Cur的胃肠释放率和生物可给率最高。

CN-SA基乳液凝胶基质均为天然来源的可食用大分子,乳液凝胶制备过程简单。本研究表明,CN-SA基乳液凝胶加工稳定性和贮藏稳定性均较高,可用于负载功能因子,在功能食品开发中具有一定的应用前景。

制作：路旭东

编辑：张逸群、李宁

审核：叶红波