【视频解读】天津科技大学于景华教授、李红娟副教授等：羊乳清蛋白部分和深度水解工艺、水解物致敏性及肽谱分析

李红娟副教授（本文第一作者）的讲解

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该文章的视频解读

乳清蛋白约占母乳蛋白质总质量的60%,是母乳中主要的蛋白质,也是婴幼儿配方奶粉中重要的配料之一。婴幼儿配方奶粉中的乳清蛋白配料主要来源于牛乳及羊乳。通过对比母乳和牛、羊乳蛋白质的成分可知,母乳乳清蛋白的质量比为0.69～0.83 g/100g,牛乳乳清蛋白的质量比为0.55～0.70 g/100 g,羊乳乳清蛋白的质量比则高达1.02 g/100 g,羊乳中乳清蛋白的含量更为丰富^[1]。食用配方奶粉的新生儿和儿童有1.0%～7.5%患乳蛋白过敏症,且可能会持续到成年并加重^[2]。牛乳、山羊乳和绵羊乳的乳清蛋白成分相似,主要含有 β-乳球蛋白(β-Lg)和α-乳白蛋白(α-La),同时这两种蛋白也是乳制品中主要的过敏原^[3]。多种哺乳动物的乳汁中均可以检测到β-Lg的存在,但母乳中几乎不含β-Lg^[4]。

目前,缓解食物过敏最有效的方法是严格规避过敏原,即避免食用乳制品,但这种方式可能会导致机体营养缺乏。为了降低或消除乳制品的过敏性,可将致敏蛋白原进行改性。降低蛋白质致敏性的传统食品加工方法有加热、发酵、高压和酶水解。β-Lg热稳定性较强,研究发现,将山羊奶在100 ℃下加热30 min,β-Lg的抗原性并未受到热处理的影响^[5]。牛奶经过发酵后其抗原性会下降,但乳酸菌不能完全破坏过敏蛋白上免疫球蛋白E(IgE)的结合表位^[6-8]。高压处理能够使隐藏在蛋白质结构中的免疫球蛋白G(IgG)结合表位暴露出来从而降低β-Lg的抗原性,但高压对样品处理量较小,不适用于规模化生产^[9]。酶解是降低蛋白质致敏性最有效的处理方法。蛋白酶可以水解蛋白质之间的肽键,将过敏肽段切割成小分子的肽或是氨基酸,破坏引起过敏反应的空间表位和线性表位,以降低乳蛋白的过敏性^[10]。目前已经开发出多种基于蛋白质水解的低致敏性婴儿配方奶粉,根据水解产物的分子质量,可分为部分水解配方和深度水解配方。一般来说,部分水解配方中肽段分子质量主要集中在3～10 kDa;深度水解蛋白要求分子质量小于3 kDa的多肽为95%以上,同时分子质量大于3.5 kDa的多肽不超过5%^[11]。

研究发现,山羊乳蛋白与IgE的结合能力显著低于牛乳蛋白,表明山羊乳具有更低的致敏性^[12-13]。目前,对于牛乳中乳清蛋白的致敏性研究较多,牛乳清蛋白水解工艺及制备方法已经趋近成熟,致敏性肽段分析也较为明确。但对于羊乳清蛋白致敏性研究仅集中在不同乳源理化特性和致敏性的差异对比,对羊乳的水解工艺和致敏性分析的研究较少。近年来,肽组学已被广泛用于肽的鉴定和表征,包括蛋白质过敏原的表征和测定^[14]。Ji等^[15]采用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)对蛋糕、饼干、华夫饼等食品中3种牛奶蛋白过敏原 β-Lg、α-La和α_S1-酪蛋白(α_S1-CN)进行了鉴定和定量分析。LC-MS/MS的灵敏度高,可对乳蛋白中的过敏原进行鉴定和分析。

本研究拟采用不同的蛋白酶对山羊乳清蛋白进行不同程度的水解,以水解度(DH)、电泳、分子质量分布、β-Lg抗原性下降率等指标,探究部分水解和深度水解羊乳清蛋白的水解工艺,并利用LC-MS/MS 对β-Lg和α-La进行致敏性和肽段分析,确定酶切位点,希望为生产低过敏性的羊乳基配料提供理论依据。

1.1 材料与试剂

山羊乳清蛋白粉(蛋白质质量分数为11%)、深度水解羊乳清蛋白粉,宜品乳业(青岛)集团有限公司。乙腈,天津市化学试剂一厂。三氯乙酸,天津市景田化工有限公司。宽分子质量预染标准蛋白质,上海斯信生物科技有限公司。山羊β-乳球蛋白(β-Lg)ELISA检测试剂盒(抗体来源为IgE),上海优选生物科技有限公司。中性蛋白酶(100 U/g)、碱性蛋白酶(200 U/g)、木瓜蛋白酶(800 U/g)、细胞色素C、抑肽酶、杆菌肽、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸,上海源叶生物科技有限公司。胰蛋白酶(250 U/g)、胃蛋白酶(3 000 U/g),上海麦克林生化科技有限公司。蛋白酶皆为食品级,分子质量标准品皆为色谱级,其余实验试剂皆为分析纯。

1.2 仪器与设备

BSA124S型电子分析天平,赛多利斯科学仪器北京有限公司;HWS24型电热恒温水浴锅,上海一恒科学仪器有限公司;H1850R型台式高速冷冻离心机,湖南湘仪离心机仪器有限公司;SynergyH1型酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;FE20Mettler型pH计,上海梅特勒托利多集团;DYCZ-24DN型电泳仪,济南海能仪器有限公司;离心过滤装置,德国默克公司;HPLC-1260型高效液相色谱仪(由G1315D系列光电二极管阵列检测系统和G1329B自动进样器注射器组成)、ZORBAX 300SB-C18型色谱柱(146 mm×250 mm,5 mm),美国安捷伦公司;Lab-1B-50E型冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司;G2000swxl TSK型色谱柱(7.8 mm×300 mm,5 mm),日本东曹有限公司;Q Exactive型超高效液相色谱-串联质谱联用仪,赛默飞世尔科技公司。

1.3 实验方法

1.3.1 羊乳清蛋白水解液的制备

根据前期预实验,将羊乳清蛋白溶液的质量分数设为15%。将羊乳清蛋白溶液在80 ℃下预热15 min,之后用1 mol/L HCl或NaOH溶液调节至各蛋白酶的最适pH值。分别加入蛋白酶,在最适温度下对羊乳清蛋白进行水解。5种蛋白酶的最适pH值和最适温度见表1^[11]。将水解液在100 ℃加热10 min进行灭酶,终止水解反应,4 000 r/min离心30 min,收集上清液,真空冷冻干燥后以供进一步分析。

表1 蛋白酶的最适pH值和最适温度

Tab.1 Appropriate reaction temperature and pH for proteases

1.3.2 羊乳清蛋白水解工艺的确定

1.3.2.1 蛋白酶的筛选

选取碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶及胰蛋白酶,并在其最适温度和最适pH值条件下水解羊乳清蛋白,其中酶底比设为4 000 U/g,水解时间为3.0 h。

1.3.2.2 羊乳清蛋白部分水解工艺的确定

选择碱性蛋白酶,在水解温度为55 ℃,pH值为10.0的条件下对样品进行部分水解。将样品分为两组,第一组水解时间(3.0 h)为定量,变量为酶底比(1 000、2 000、4 000、6 000、8 000 U/g);第二组酶底比(4 000 U/g)为定量,变量为水解时间(0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h)。

1.3.2.3 羊乳清蛋白深度水解工艺的确定

根据前期预实验,深度水解的蛋白酶选择中性蛋白酶和碱性蛋白酶以质量比1∶1复合,pH值为8.5,温度为50 ℃。研究复合蛋白酶在不同酶底比(1 000、2 000、4 000、6 000、8 000 U/g)和不同水解时间(0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h)对羊乳清蛋白水解的影响,探究羊乳清蛋白深度水解工艺。

1.3.3 水解度的测定

采用甲醛滴定法测定DH,参考Qin等^[11]的DH测定方法并稍加修改。将1 mL的灭酶水解液置于烧杯中,加60 mL蒸馏水,将pH值调节至8.2,然后将10 mL甲醛加入试样中均匀混合,用1 mol/L NaOH溶液调节pH值至9.2,记录此时NaOH溶液的消耗体积,即为V₁;以同样的方法,测定空白实验组,记录消耗的标准NaOH溶液体积,即为V₂。DH计算方法如式(1)。

(1)

式(1)中:c为标准NaOH溶液浓度,mol/L;V₁为滴定时样品消耗标准NaOH溶液的体积,mL;V₂为试剂空白消耗标准NaOH溶液的体积,mL;V₃为试剂稀释液取用量,为1 mL;S为底物质量浓度,g/mL;W为样品中蛋白质的质量分数,%;h_tot是蛋白质中肽键总数,mmol/g,乳清蛋白的肽键总数为8.8 mmol/g。

1.3.4 SDS-PAGE分析

采用质量分数为12%的分离胶和5%的浓缩胶,样品与上样缓冲液按体积比1∶1混合,上样量为20 μL^[16]。设定电泳仪电压为80 V,待样品进入分离胶时调节电压为120 V。条带到达底部后,染色30 min,放入脱色液中进行脱色直至凝胶背景清晰。

1.3.5 水解物致敏性的测定

采用双抗体一步夹心-酶联免疫吸附法对羊乳清蛋白水解液的致敏性进行测定。将预先涂有羊乳清蛋白特异性抗体的微孔酶标板在室温下平衡20 min,标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL,样品孔加待测样本10 μL和样品稀释液40 μL。除空白孔外,每孔加入100 μL经辣根过氧化物酶标记(HRP)的检测抗体,用封板膜封住反应孔,恒温箱37 ℃避光温育60 min。清洗平板,加入底物A、B各50 μL,37 ℃避光孵育15 min。最后加入终止液50 μL,颜色变为黄色,颜色深浅与样品中的β-Lg含量呈正相关,在5 min内用酶标仪在450 nm处测定吸光值,绘制标准曲线。β-Lg抗原性下降率的计算方法如式(2)。

β-Lg抗原性下降率

(2)

式(2)中,WP1为原乳清蛋白中的β-Lg的质量分数,WP2为水解物中β-Lg的质量分数。

1.3.6 水解物分子质量分布的测定

参考Li等^[17]的方法并适当修改。采用HPLC法测定羊乳清蛋白的分子质量(M_w)分布。采用G2000swxl TSK色谱柱,检测器为紫外检测器,检测波长为220 nm,流速为0.5 mL/min,进样量为20 μL,检测时间为30 min,柱温为25 ℃。流动相由乙腈、水和三氟乙酸(体积比为20.0∶80.0∶0.1)混合,并在0.45 μm超滤膜处理。以细胞色素C(M_w为12.5 kDa)、抑肽酶(M_w为 6.5 kDa)、杆菌肽(M_w为1.42 kDa)、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸(M_w为451 Da)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(M_w为189 Da)为分子质量标准品绘制相对分子质量标准曲线,用来计算不同分子质量的色谱峰保存时间。

1.3.7 过敏肽段的测定

采用LC-MS/MS鉴定部分水解产物和深度水解产物的肽段水解情况。使用超滤装置和C18色谱柱对水解液进行超滤和脱盐。流动相A为体积分数为0.1%的甲酸水溶液,B液为甲酸与乙腈混合液(甲酸、乙腈、水体积比为0.1∶84.0∶16.0)。先用体积分数为95%的A液平衡色谱柱,分离过程采用梯度洗脱,洗脱条件如表2。水解液经色谱分离后用质谱仪进行60 min质谱分析,采用正离子检测,数据收集按照每次全扫描后采集10个碎片图谱。检索的数据库为Uniprot(https:∥www.uniprot.org/),使用MaxQuant软件(版本1.6.2.0)处理得到质谱文件。

表2 色谱洗脱条件

Tab.2 Chromatographic elution conditions

1.4 数据处理

所有实验重复3次,数值用平均值±标准偏差表示。采用SPSS 26.0软件对数据进行显著性差异分析,P<0.05表示差异显著。使用Origin 8.0软件绘图。

2.1 不同蛋白酶对羊乳清蛋白水解能力的比较

2.1.1 不同蛋白酶对羊乳清蛋白的水解程度分析

DH是蛋白质水解过程中被裂解的肽键占总肽键的比例,能够反映蛋白质的水解程度,可以作为重要指标来筛选对反应底物水解效果好的蛋白酶^[18-19]。蛋白酶和底物的特异性决定DH^[20]。图1是不同蛋白酶水解羊乳清蛋白的DH结果。从图1可知,5种蛋白酶的DH由高到低为:碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶。不同蛋白酶对羊乳清蛋白DH的影响程度不同,其中碱性蛋白酶DH最高,为21.26%;而胃蛋白酶DH最低,为7.12%。胃蛋白酶是一种酸性蛋白酶,在碱性和中性环境下会失活,能将蛋白质氨基端或羧基端的芳香族氨基酸的肽键分解,具有强特异性。由于乳清蛋白在酸性环境下溶解度较差,且胃蛋白酶属于外肽酶,分子内的肽键不能被有效水解,因此胃蛋白酶的水解程度较低。胰蛋白酶与胃蛋白酶性质相似,但对乳清蛋白水解的效果稍强。木瓜蛋白酶是一种从木瓜果实中提取得到的天然生物酶,底物特异性十分广泛,可切割疏水区域的肽键,包括苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、颉氨酸(Val)和色氨酸(Trp)^[21]。无论是酸性还是碱性环境,木瓜蛋白酶都能有效水解乳清蛋白。碱性蛋白酶属于内切酶,作用底物十分广泛,乳清蛋白在碱性环境下溶解度高,因此碱性蛋白酶水解乳清蛋白的效果更好。中性蛋白酶属于内肽酶,特异性不强,水解乳清蛋白的效果不如碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶,为达到更好的水解效果一般采用复合酶进行水解^[22]。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图1 不同蛋白酶水解羊乳清蛋白的水解度

Fig.1 Degree of hydrolysis of goat whey protein by different proteases

2.1.2 不同蛋白酶的羊乳清蛋白水解物SDS-PAGE分析

乳清蛋白的主要成分是β-Lg(分子质量为18.4 kDa)和α-La(分子质量为14.2 kDa),是引起婴幼儿过敏的主要过敏原^[23]。对不同蛋白酶的水解物进行SDS-PAGE定性分析,实验结果如图2。由图2可知,在未水解的羊乳清蛋白中,含量最高的蛋白组分为β-Lg。β-Lg的空间结构致密,具有耐胃蛋白酶消化的特点,不易在人体胃肠道中降解^[4]。碱性蛋白酶水解液中分子质量在25 kDa以下的条带完全消失,其中β-Lg被完全水解。碱性蛋白酶的水解效果优于其他蛋白酶,具有更高的水解效率。这可能是由于碱性蛋白酶作用位点广泛,且其作用于蛋白质内的肽键,破坏蛋白质分子内的抗原结合位点,有效降低了蛋白质的过敏原性^[24-26]。木瓜蛋白酶水解物中分子质量在25 kDa以上的条带完全消失,木瓜蛋白酶对大分子蛋白水解较为彻底,但其无法有效水解β-Lg和α-La。胃蛋白酶对羊乳清蛋白的水解效果最差,故不选用胃蛋白酶进行后续实验。胰蛋白酶同样不易水解β-Lg,这可能是因为天然β-Lg的球状结构对胰蛋白酶具有抗性。中性蛋白酶对β-Lg水解效果差,但对α-La水解较为完全。因此,单一蛋白酶水解羊乳清蛋白无法达到深度水解的效果。为了将乳清蛋白水解完全,通常会采用复合酶(碱性蛋白酶和中性蛋白酶)同步水解^[22]。韩仁娇等^[26]采用复合的碱性蛋白酶和中性蛋白酶水解牛乳清蛋白,发现碱性蛋白酶和中性蛋白酶同时添加时可以使β-Lg的水解率高达58.99%,复合酶的水解物明显优于市售的同类产品。

泳道1～6:中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶的水解产物和蛋白Marker。泳道7～8为对照组,7为未水解的羊乳清蛋白,8为市售的深度水解羊乳清蛋白。

图2 不同蛋白酶水解产物的SDS-PAGE

Fig.2 SDS-PAGE of hydrolysates of different proteases

2.1.3 不同蛋白酶对羊乳清蛋白水解物分子质量分布的影响

分子质量分布可以更直观地反映蛋白质的水解程度。蛋白酶特异性的差异会使水解产物在分子质量分布上有所不同,5种蛋白酶水解物分子质量的分析结果见图3。由图3可知,与未水解的乳清蛋白相比,水解后分子质量为1～5 kDa的组分显著增加,大于5 kDa的组分含量显著减少,且碱性蛋白酶水解乳清蛋白的效果最好,这与SDS-PAGE分析结果一致。与其他3种蛋白酶相比,中性蛋白酶水解物中小分子质量组分较多,分子质量小于1 kDa的组分为42.63%。胰蛋白酶水解物中分子质量为 1～5 kDa和5～10 kDa的组分分别为45.76%和12.00%。在中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的酶解产物中分子质量在3 kDa以下的组分分别为75.01%、73.67%、68.44%、54.55%,而深度水解产物的要求是蛋白质分子质量小于3 kDa的寡肽应为95%以上,这表明单一的蛋白酶不能达到深度水解的要求。碱性蛋白酶和中性蛋白酶的小分子肽占比更多,水解产物中分子质量在5 kDa以下的组分为90%以上,已达到部分水解的要求。虽然分子质量和抗原性之间并没有直接的关系,但许多研究表明,与分子质量较小的多肽相比,分子质量较大的多肽引起过敏反应的几率更高^[17]。Van Beresteijn等^[27]也发现,分子质量小的乳清蛋白水解物更不易引起过敏反应。

WP为未水解的羊乳清蛋白。

图3 不同蛋白酶水解产物的分子质量分布

Fig.3 Molecular weight distribution of hydrolysates of different proteases

通过2.1.2和2.1.3的分析可知,胃蛋白酶是酸性蛋白酶,而乳清蛋白在酸性条件下溶解度较差,因此胃蛋白酶水解液的DH较差。胰蛋白酶无法将β-Lg水解完全,这可能是由于β-Lg的球状结构未被完全打开。乳清蛋白在碱性条件下更易降低其抗原性,而碱性蛋白酶的DH较高且可将β-Lg水解完全。对不同蛋白酶的水解物进行分子质量分布测定发现,单一的蛋白酶水解无法达到深度水解的要求,因此需要复合蛋白酶水解羊乳清蛋白。碱性蛋白酶和中性蛋白酶的小分子肽占比更多,有研究也表明,碱性蛋白酶和中性蛋白酶结合可以更加有效地切断乳清蛋白的多肽链,达到深度水解的要求^[17]。综合考虑,选用碱性蛋白酶作为部分水解配方的蛋白酶,选择碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行复配作为深度水解的蛋白酶。

2.2 羊乳清蛋白部分水解工艺的确定及水解物致敏性分析

为了进一步确定羊乳清蛋白部分水解的工艺,考察了影响酶解的两个重要因素酶底比和水解时间,并分析酶底比和水解时间对水解产物DH、分子质量分布以及β-Lg抗原性的影响。

2.2.1 部分水解羊乳清蛋白水解度及致敏性分析

酶解过程能有效破坏蛋白过敏原线性表位的位点,使得蛋白质的致敏性下降。图4是碱性蛋白酶在不同酶底比和水解时间条件下水解物的DH及 β-Lg抗原性变化的分析。由图4(a)可知,随着酶底比的增加,水解物的β-Lg抗原性下降率呈现增加的趋势,在酶底比为8 000 U/g时β-Lg抗原性下降率为35.06%。由图4(b)可知,在1.0 h和2.0 h时DH增加最快,分别为12.31%和20.72%。当水解时间为3.0 h时,DH高达24.36%。当水解时间为1.0 h和2.0 h时,水解产物的β-Lg抗原性下降率分别为9.40%和19.02%。当酶底比为4 000 U/g和6 000 U/g,水解产物的DH和β-Lg抗原性下降率变化不显著,这可能是因为随着水解的进行,蛋白质的结构开始发生变化,蛋白质内部的过敏原可能被破坏或暴露,或形成新的过敏原,因此水解物的抗原性和DH变化不显著^[28]。可通过不同酶底比和水解时间的组合,显著降低羊乳清蛋白抗原性。

不同大写字母代表羊乳清蛋白水解度差异显著,不同小写字母代表羊乳清蛋白β-Lg抗原性下降率差异显著。

图4 羊乳清蛋白碱性蛋白酶水解物水解度及β-Lg抗原性的变化

Fig.4 Changes of degree of hydrolysis and β-Lg antigenicity of goat whey protein hydrolysates by alkaline protease

2.2.2 部分水解羊乳清蛋白的分子质量分布

部分水解工艺的标准为分子质量大于6 kDa的多肽,在水解物中不能超过18%^[11]。图5是碱性蛋白酶水解物在不同酶底比和水解时间条件下的分子质量分布。由图5可知,在酶底比为4 000 U/g时,大分子蛋白几乎完全被水解为分子质量小于10 kDa的小分子蛋白,分子质量小于1 kDa的肽段为38.72%,水解程度较高。当水解1.0 h时,水解物中分子质量大于20 kDa的肽段仅为0.94%,小于5 kDa的肽段为95.18%。在酶底比为4 000 U/g的水解条件下,将碱性蛋白酶水解1.0 h,水解产物的分子质量已经满足部分水解产物的标准,因此部分水解选用此水解条件。党慧杰等^[29]利用碱性蛋白酶水解牛乳清蛋白制备低致敏性乳制品,发现碱性蛋白酶可以将乳清蛋白中具有致敏性的大分子蛋白质酶解为小分子的多肽,大大降低其致敏性。增加小分子多肽的含量可以显著降低乳制品蛋白的致敏性^[20]。因此确定部分水解工艺:在酶底比为4 000 U/g的条件下,使用碱性蛋白酶水解1.0 h。部分水解羊乳清蛋白的DH为12.31%,β-Lg抗原下降率为9.40%,小于5 kDa的肽段为95.18%。

E后数字为酶底比,U/g;T后数字为水解时间,h;WP为未水解的羊乳清蛋白。

图5 羊乳清蛋白碱性蛋白酶水解物的分子质量分布

Fig.5 Molecular weight distribution of goat whey protein hydrolysates by alkaline protease

2.3 羊乳清蛋白深度水解工艺的确定及水解物致敏性分析

为了进一步确定羊乳清蛋白深度水解的工艺,分析了酶底比和水解时间对水解产物DH、分子质量分布以及β-Lg抗原性的影响。

2.3.1 深度水解羊乳清蛋白水解度及致敏性分析

单一的蛋白酶水解山羊乳清蛋白无法达到深度水解的要求,与单一的蛋白酶水解效果相比,复合的蛋白酶可以在最大程度上消除蛋白质的过敏性。这是因为,几种蛋白酶结合在一起可以扩大水解的位点和蛋白酶的作用范围,更好地提高水解的效率^[30-31]。图6是将中性蛋白酶和碱性蛋白酶复配后在不同的酶底比和水解时间下水解物的DH及 β-Lg 抗原性变化的分析。由图6可知,与单一蛋白酶的水解效果相比,复合蛋白酶可以显著降低乳清蛋白的抗原性。由图6(a)可以看出:当酶底比在 2 000～6 000 U/g时,DH迅速上升,致敏肽段被破坏,β-Lg抗原性随之降低;当酶底比为6 000 U/g时趋于稳定,DH为43.64%,β-Lg抗原性下降率为53.26%。由图6(b)可以看出,随着水解时间的延长,DH不断增加,1.5～3.0 h增长较快,从21.12%增加到35.58%,在3.0 h时β-Lg抗原性下降率达到40.97%。综合来看,复合酶的水解效率是要高于单一蛋白酶的,原因是复合蛋白酶的作用范围更加广泛,因此提高了酶解效率。

不同大写字母代表羊乳清蛋白水解度差异显著,不同小写字母代表羊乳清蛋白β-Lg抗原性下降率差异显著。

图6 羊乳清蛋白复合酶水解物的水解度及β-Lg抗原性的变化

Fig.6 Changes of degree of hydrolysis and β-Lg antigenicity of goat whey protein hydrolysates by compound enzymes

2.3.2 深度水解羊乳清蛋白的分子质量分布

深度水解物中分子质量大于3.5 kDa的多肽应为1%～5%,图7是复合酶在不同酶底比和水解时间条件下水解物的分子质量分布。由图5和图7对比可知,复合酶水解羊乳清蛋白较单酶水解更为彻底,水解产物中小分子肽(分子质量小于1 kDa)的含量较多,小分子多肽含量的增加会大大降低蛋白质的致敏性,这与DH和β-Lg抗原性测定结果一致^[32]。随着蛋白酶的添加量和水解时间的增加,酶解产物中分子质量小于1 kDa的组分占比逐渐增加,分子质量大于20 kDa的蛋白质已被完全水解。当不同的蛋白酶组合使用时,它们之间的协同作用会在多肽上切割更多的位点,从而获得低致敏性的水解物^[17]。在酶底比为6 000 U/g和8 000 U/g时,分子质量小于3 kDa的水解物分别为97.26%和97.89%,水解物的分子质量分布没有明显差异。当水解时间为3.0 h时,分子质量小于3 kDa的水解物为95%以上。酶底比为6 000 U/g的水解条件下,将复合蛋白酶水解3.0 h,水解产物的分子质量已经满足深度水解产物的要求。因此考虑实际生产和节能,确定深度水解工艺:使用复合蛋白酶(碱性蛋白酶和中性蛋白酶质量比为1∶1),酶底比为6 000 U/g,水解时间为3.0 h。深度水解羊乳清蛋白的DH为35.58%,β-Lg抗原下降率为40.97%,小于3 kDa的肽段为97.26%。

E后数字为酶底比,U/g;T后数字为水解时间,h;WP为未水解的羊乳清蛋白;SWP为市售的深度水解羊乳清蛋白。复合酶在不同酶底比下的水解时间为3 h;在不同水解时间下的酶底比为4 000 U/g。

图7 复合酶羊乳清蛋白水解物的分子质量分布

Fig.7 Molecular weight distribution of goat whey protein hydrolysates by compound enzymes

2.4 部分和深度水解羊乳清蛋白的酶切位点分析

为了进一步探究蛋白酶对过敏肽段的切割情况,比较部分水解产物和深度水解产物致敏性的差异,采用LC-MS/MS对水解后的羊乳清蛋白肽段进行分析。牛与山羊的乳蛋白序列同源性较高,β-Lg 和α-La的序列同源性高达96.3%和94.3%,因此通过牛乳的β-Lg和α-La的抗原表位结合 DNASTAR 软件、SOPMA服务器、THE BEPIPRED2.0网络服务器,预测山羊孔的β-Lg和α-La的抗原表位^[33-34],分析结果如图8。

红色横线为预测的羊乳清蛋白中β-Lg和α-La的抗原表位,蓝色竖线为蛋白酶对β-Lg的酶切位点,绿色竖线为蛋白酶对α-La的酶切位点。

图8 部分水解产物和深度水解产物中β-Lg和α-La的酶切位点

Fig.8 Protease cleavage sites for β-Lg and α-La in partial and extensive hydrolysates products

乳清蛋白经过蛋白酶水解形成不同长度的肽段,通过LC-MS/MS分析得到部分水解产物中含8个以上氨基酸的肽段有1 046个,分子质量分布在0.78～2.99 kDa,而深度水解产物中则有951个,分子质量的范围为0.74～2.89 kDa。LC-MS/MS的分析结果和分子质量分布测定的结果一致,深度水解产物的分子质量更小,这进一步说明,复合酶与单一的蛋白酶相比,切割肽段的效率更高,切割位点更加细致。图8是部分和深度水解产物中β-Lg和α-La的裂解位点。由图8(a)和图8(c)可知,部分水解产物中β-Lg的酶切位点主要集中在I19～A34位、E83～A98位、E126～Q133位和T143～K148位;而深度水解产物则主要集中在V21～K32位、E62～G70位、N81～P97位、L105～V110位、E126～Q133位和T143～F154位。深度水解对过敏肽段破坏得更完全,大部分过敏表位都可以被切割。部分水解物中α-La仅仅被破坏了3个过敏原表位,深度水解物中则被切割了6个位点。水解产物中仍存在一些含有抗原表位的肽段,这说明无论是碱性蛋白酶还是复合蛋白酶都不能完全破坏α-La过敏原的抗原表位^[19]。

本研究选择了5种蛋白酶对山羊乳清蛋白进行水解,通过水解度、分子质量分布、SDS-PAGE等指标确定了部分水解和深度水解工艺,并对部分水解和深度水解产物中α-La和β-Lg酶切位点进行了研究。确定的部分水解工艺:使用碱性蛋白酶,酶底比为4 000 U/g,温度为55 ℃,pH值为10.0,水解时间为1.0 h。深度水解工艺:中性蛋白酶和碱性蛋白酶复配质量比为1∶1,温度为50 ℃,pH值为8.5,酶底比为6 000 U/g,水解时间为3.0 h。部分水解和深度水解都能破坏β-乳球蛋白的大部分过敏表位,其中深度水解能更大程度地降低乳清蛋白的致敏性。为了进一步验证部分水解和深度水解山羊乳清蛋白产物的致敏性,后续会进行更有效的致敏性评估,如动物实验、皮肤点刺实验等。本研究旨在为利用羊乳清蛋白开发低致敏性乳基蛋白配料提供理论依据,同时为羊乳清蛋白在特医食品中的应用提供技术参考。

制作：路旭东

编辑：张逸群、李宁

审核：叶红波