【视频解读】广东海洋大学曹文红教授等：龙趸石斑鱼肝脏维生素A的形态分布及其对干眼症细胞模型的影响

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该文章的视频解读

维生素A是维持人体生长、繁殖、免疫,保持上皮组织完整及功能正常所必需的脂溶性维生素,缺乏时会导致生长迟缓、夜盲症、干眼症、免疫下降等^[1]。哺乳动物自身不能合成维生素A,需要通过饮食摄入。维生素A的饮食来源有天然维生素A和合成维生素A两种,天然的与合成的维生素A除在来源上不同之外,它们在化学结构、生物活性及人体的吸收利用上都有差距^[2]。人体可以通过消化系统直接分解利用动物性来源的天然维生素A。鱼类肝脏含有丰富的天然维生素A,是获取天然维生素A的优质原料。目前,人们主要是从鳕鱼及鲨鱼肝脏中提取鱼肝油并将其作为优质的天然维生素A补充剂。但近年来国内的鳕鱼主要依赖进口,来源受限,且价格昂贵,而鲨鱼肝自然资源日渐匮乏,因而人们转向我国出产较多的一些鱼类进行研究^[3]。龙趸石斑鱼(Epinephelus drummondhayi)在广东养殖产量大,受消费饮食习惯影响,人们通常将龙趸石斑鱼内脏丢弃。龙趸石斑鱼肝脏的天然维生素A含量丰富^[4],如何有效利用这部分资源亟待解决。目前维生素A酯的研究对象多为小鼠肝脏、配方奶粉、动物乳等,仅有一些针对鱼肝油^[5-6]的研究,少见对鱼肝脏天然维生素A酯的研究和开发。

外用维生素A棕榈酸酯滴眼液治疗能改善干眼症状,提高角膜染色评分和小泡细胞密度,对各种原因引起的角膜干燥症均有良好的治疗效果^[7]。苯扎氯铵诱发的干眼症模型是一种药物毒性诱发的干眼症模型,具有眼表细胞损伤和炎症,可用于评估一些新疗法或药物对干眼症的治疗或保护效果^[8]。本研究拟选用我国沿海地区产量较大的龙趸石斑鱼肝脏为原料,分析其肝脏中天然维生素A的形态及分布;以合成维生素A棕榈酸酯为对照,选用 CCK-8 法检测鱼肝脏中性脂中分离得到天然维生素A棕榈酸酯含量较高的F3组分对人角膜上皮细胞的毒性;采用实时荧光定量法检测细胞内炎症因子(IL-6、IL-1β及TNF-α)的基因表达,探究天然与合成维生素A棕榈酸酯对苯扎氯铵诱导的干眼症细胞模型的影响及二者的差异,以评估龙趸石斑鱼肝脏中天然维生素A酯的安全性及其对干眼症的辅助治疗作用。本研究旨在探索天然维生素A棕榈酸酯与合成维生素A棕榈酸酯生理活性之间的差异,为石斑鱼肝脏中天然维生素A的开发和利用提供理论参考。

1.1 材料与试剂

龙趸石斑鱼(湛江南三岛人工养殖),购于广东省湛江霞山水产品批发市场。鱼肝脏样品制作方法:现杀鱼后将肝脏取出,去除表面脂肪及结缔组织,用预冷的生理盐水清洗后吸干表面水分,匀浆后立即冻存于-80 ℃冰箱。

三氯甲烷,广州化学试剂公司;丙酮,中国国药集团;抗坏血酸、无水硫酸钠、氢氧化钾、石油醚、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、氯化钙、异丙醇、氯化钾,汕头西陇公司;乙腈,美国Thermo Fisher公司;甲醇,美国Sigma-Aldrich公司。以上试剂除乙腈、甲醇为色谱纯外,其他试剂均为分析纯。维生素A棕榈酸酯标准品(VAP),纯度≥96%,上海源叶生物科技公司。

人角膜上皮细胞(HCE-T),广州赛库生物公司;DMEM/F-12培养基,美国HyClone公司;0.25%胰酶(含EDTA)、双抗,美国Gibco公司;重组人胰岛素,北京索莱宝公司;人表皮生长因子,上海爱必信公司;胎牛血清(中南美)、磷酸缓冲盐溶液(PBS),美国Biological Industries公司;苯扎氯铵(纯度≥95%),美国Sigma-Aldrich公司;CCK-8试剂盒,日本同仁化学公司;Trizol试剂,美国Invitrogen公司;DNase、PrimeScript RT-PCR试剂盒,北京Takara公司。

1.2 仪器与设备

e2695型高效液相色谱仪(配置2489紫外检测器)、XEVO G2-XS QTOF 型质谱仪,美国Waters公司;DU-1100型真空冷冻干燥机、N-1300型旋转蒸发仪、MGS-2200H型氮吹仪,上海爱朗公司;FDMI4000B型倒置荧光显微镜,日本Olympus公司;SW-CJ-2FD型超净工作台,苏州净化公司;5810R型离心机,德国Eppendorf公司;Varioskan Flash型酶标仪、Forma 370型CO₂恒温培养箱、NanoDrop 2000 型RNA测定仪,美国Thermo Fisher公司;7500型应用生物系统,美国应用生物系统公司;HGC-8型固相萃取仪,上海禾工公司;GCMS-TQ8050NX型气相色谱-质谱联用仪、LC-20A型液相色谱仪,日本岛津公司; Vulcan3-550 型马弗炉,美国Neytech公司;Vapodest-450型全自动凯氏定氮仪,德国Gerhardt公司;QuikSep-50D型层析系统,北京慧德易公司。

1.3 实验方法

1.3.1 龙趸石斑鱼肝脏中游离维生素A的提取

参考侯利南等^[9]游离维生素A的提取方法,并稍加改动。准确称取肝脏2 g,加入40 mL甲醇超声(超声功率为240 W,频率为40 kHz)15 min,10 000 r/min离心10 min,取上清液对游离维生素A进行检测。

1.3.2 龙趸石斑鱼肝脏中维生素A的测定

采用水浴皂化法结合反相色谱法测定龙趸石斑鱼肝脏脂质中各组分维生素A的含量^[4]。准确称取1.6 g龙趸石斑鱼肝脏于棕色锥形瓶中,加入20 mL水混匀,加入1.0 g抗坏血酸和0.1 g BHT作为抗氧化剂。向锥形瓶中加入30 mL无水乙醇,并加入10 mL质量分数为50%的氢氧化钾溶液作为皂化液,混匀后盖上瓶塞于80 ℃恒温水浴振荡皂化30 min,皂化后立即用冰水冷却。将皂化液用30 mL水转入250 mL棕色分液漏斗中,加入石油醚振荡萃取5 min。将下层水相移至另一分液漏斗中进行第二次提取,合并醚相并水洗至中性后经3 g无水硫酸钠滤入1 L旋转蒸发瓶中,并在旋转蒸发仪上浓缩至近干。用甲醇分次溶解残留物后定容至10 mL,过0.22 μm滤膜后待测。

将配置好的维生素A1和A2混合标准系列工作液在反相色谱进样制得标准曲线。反相色谱法条件: BEH C18型色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇与水(二者体积比为96∶4),流速0.8 mL/min,进样量10 μL。

1.3.3 龙趸石斑鱼肝脏中总脂的提取及脂质分级

采用Floch法提取龙趸石斑鱼肝脏的总脂,参考黎崎均等^[10]的方法对脂质进行分级。将样品加入氯仿-甲醇(二者体积比为2∶1)混合溶剂中,样品与混合溶剂的料液比(g∶mL)为1∶30。在磁力搅拌器中浸提30 min,过滤。向过滤得到的固体中分次加入20 mL混合溶剂冲洗,再加入10 mL 0.05 mol/L的氯化钙溶液。将下层氯仿溶液于25 ℃旋转蒸发仪中浓缩至干,以氮气吹扫至恒重,称重即获得总脂。将龙趸石斑鱼肝脏总脂用氯仿溶解至0.05 g/mL,使用固相萃取仪进行萃取,流速控制在1 mL/min,每次上样量为1 mL。上样前先用10 mL甲醇活化Sep-PakTM固相萃取小柱,再使用30 mL氯仿平衡柱子。随后先使用25 mL氯仿,冲出中性脂组分,然后使用20 mL丙酮,冲出糖脂组分,再使用15 mL甲醇冲出磷脂组分。

1.3.4 龙趸石斑鱼肝脏中脂质组分的质谱鉴定

参考Rocchi等^[5]和顾霄等^[6]的方法并稍加改动,对龙趸石斑鱼肝脏脂质组分进行质谱测定。龙趸石斑鱼肝脏脂质的3种甘油酯样品及维生素A棕榈酸酯标准品均采用流动相稀释至约50 μg/mL,超声10 min(超声功率为240 W,频率为40 kHz),过滤后待上机。流动相为乙腈与甲醇混合液(二者体积比为85∶15),检测波长为328 nm,采用UPLC BEH C18型色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)。采用电喷雾正离子化(ESI⁺)检测,一级锥孔电压为20 V,破碎电压为20～30 V,干燥气流为700 L/h,干燥器温度为450 ℃,扫描范围m/z为100～1 000。

1.3.5 龙趸石斑鱼肝脏中性脂组分制备液相的分离鉴定

在制备液相中,样品以质量浓度为30 mg/mL进样,采用BEH C18型色谱柱(250 mm×10 mm,5 μm),以乙腈与异丙醇(二者体积比85∶15)混合液为流动相,流速为1 mL/min,检测波长为328 nm,进样量为0.1 mL。

1.3.6 干眼症细胞模型的建立

参照文献[11],取对数生长的HCE-T(在含10%的胎牛血清,5 μg/mL的胰岛素,10 ng/mL人表皮生长因子,1%双抗的DMEM/F12培养基中,于37 ℃,5% CO₂培养箱中培养),以1×10⁵
个/mL的密度接种于96孔培养板中,每孔100 μL。于37 ℃,5% CO₂
培养箱培养24 h后,更换新的完全培养液。以1 μg/mL的苯扎氯铵作用于细胞,建立干眼症细胞模型。

1.3.7 样品浓度的筛选

取对数生长的HCE-T,按照1.3.6的条件培养24 h,更换新的完全培养液。选取质量浓度为2.86、14.30、28.60、85.80、143.00、200.00、286.00 pg/mL的F3组分作用于HCE-T,每组5个复孔。培养24 h后,每孔加入10 μL CCK-8试剂继续培养1.5 h,在酶标仪450 nm波长处测定吸光值。按照CCK-8试剂说明书计算细胞存活率,计算方法见式(1)。

细胞存活率=(A_s-A_b)/(A_c-A_b)×100% 。

(1)

式(1)中,A_s为实验孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8 溶液、药物溶液),A_b为空白孔吸光度(含培养基、CCK-8 溶液,不含细胞、药物溶液),A_c为对照孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液,不含药物溶液)。

1.3.8 细胞活性的检测

根据低、中、高剂量F3组分中维生素A棕榈酸酯的含量计算出相应维生素A棕榈酸酯标准品的剂量。实验设置8个组:正常情况下培养的HCE-T为正常组(NC)、干眼症细胞模型组(MC)、低剂量F3实验组LF3(干眼症模型+28.60 pg/mL的F3)、中剂量F3实验组MF3(干眼症模型+85.80 pg/mL 的F3)、高剂量F3实验组HF3(干眼症模型+286.00 pg/mL的F3)、低剂量维生素A棕榈酸酯标准品对照组LVAP(干眼症模型+35.60 pg/mL 的维生素A棕榈酸酯)、中剂量维生素A棕榈酸酯标准品对照组MVAP(干眼症模型+106.0 pg/mL的维生素A棕榈酸酯)、高剂量维生素A棕榈酸酯标准品对照组HVAP(干眼症模型+356.00 pg/mL的维生素A棕榈酸酯),每组5个复孔。培养24 h后更换新的完全培养基,每孔加入10 μL CCK-8试剂,继续培养1.5 h,在酶标仪450 nm波长处测定吸光值。按照式(1)计算细胞存活率。

1.3.9 细胞内炎症因子的检测

因荧光定量法检测所需要的细胞数量较多,因而此方法的细胞接种条件略有不同。取对数生长的HCE-T,以1×10⁶个/mL的密度接种于6孔培养板中,每孔2.5 mL,于37 ℃,5% CO₂培养箱中培养24 h后,更换新的完全培养液。实验分组与1.3.8相同。细胞培养24 h后,用PBS润洗3次,再用Trizol试剂从细胞中提取总RNA,在1.0%变性琼脂糖凝胶上电泳检测提取RNA的完整性。用RNA测定仪测定RNA的纯度和浓度,合格的RNA用无RNA的DNase试剂处理以去除DNA污染物,并根据Novizan R223逆转录试剂盒说明书,用PrimeScript RT-PCR试剂盒逆转录cDNA。通过实时荧光定量聚合酶链反应(QPCR)检测细胞中炎症因子相关基因的表达。QPCR反应在应用生物系统7500中用SYBR Premix ExTaqTMⅡ套件进行。根据炎症因子的序列设计引物,引物序列见表1,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以β-肌动蛋白(β-actin)作为内部参考基因,定量PCR反应体系组成:10 μL的2 x ChamQ SYBR qPCR Master Mix,0.4 μL的PCR Forward Primer(10 μmol/L),0.4 μL的PCRR everse Primer(10 μmol/L),4 μL的cDNA模板和5.2 μL ddH₂O。PCR反应条件:95 ℃预变性70 s;95 ℃、5 s;60 ℃、15 s;72 ℃延伸20 s,40个循环。按照2^-△△Ct方法计算目标基因的表达水平。

表1 炎症因子对应的基因引物、探针序列

Tab.1 Gene primer and probe sequence corresponding to inflammatory factors

1.4 数据处理

所有实验重复3次,数据以平均值±标准差表示。使用One-way ANOVA进行单因素方差分析,若差异显著则采用Duncan法进行多重比较,以P<0.05作为差异显著性的判断标准。

2.1 维生素A形态分析

维生素A主要有两种存在形式,结合态和游离态。按1.3.2的方法测得龙趸石斑鱼肝脏中游离态维生素A的含量。结合态维生素A含量的计算方法参考Gupta等^[12]的方法,以总维生素A含量减去游离状态的维生素A含量,计算结果见图1。

图1 龙趸石斑鱼肝脏中结合态及游离态维生素A含量

Fig.1 Content of bound and free vitamin A in liver of Epinephelus
drummondhayi

由图1可知,龙趸石斑鱼肝脏中99.57%的维生素A以结合态形式存在,游离态维生素A仅占0.43%。在大鼠和人类中,通过食物吸收进入体内的维生素A,80%以上是以酯化结合形式储存于体内组织器官中的,其主要与长链饱和脂肪酸酯化,且90%以上存在于肝脏中,肝脏中几乎所有的维生素A都是以维生素A结合酯化的形式存在的,只有少数为游离态维生素A^[5]。脂肪结合态有助于防止体内维生素A过量时的中毒现象,维生素A酯还具有抵抗体内维生素A循环中自由基氧化的作用^[13]。不同的维生素A酯因结合的脂肪酸不同,对于机体的作用也会有所不同,主要由其结合的脂肪酸种类所决定,其同时具有维生素A的生理功能及对应脂肪酸所具有的功能^[14]。

2.2 脂质组分维生素A含量分析

维生素A是脂溶性维生素,所以先提取龙趸石斑鱼肝脏总脂,再对总脂进行分级。鱼肝脏油脂主要成分为甘油酯,根据极性和结构的差异,甘油酯又分为中性脂、糖脂和磷脂。将提取的龙趸石斑鱼肝脏总脂进行分级,得到各脂质占比,结果见图2。由图2可知,龙趸石斑鱼肝脏总脂中中性脂质量分数最高,为86.84%;糖脂为9.85%;磷脂最少,为0.73%。深海长尾鲨鱼肝脏脂质中性脂质量分数最高,为50.0%;其次是磷脂,为17.5%^[15]。

图2 龙趸石斑鱼肝脏3种甘油酯组分在总脂中的占比

Fig.2 Proportion of three triglyceride fractions in the total lipids extracted from liver of Epinephelus
drummondhayi

鲣鱼肝脏总脂中磷脂质量分数最高,为28.3%;其次是中性脂,为26.0%;糖脂含量最少^{[16 ]}。不同鱼类肝脏中的脂质组成各具特征,对鱼肝脏资源开发利用时应结合鱼肝自身特征进行定向利用。

对龙趸石斑鱼肝脏3种酯质组分中维生素A含量及总维生素A进行分析,结果见表2。

表2 龙趸石斑鱼肝脏各脂质组分维生素A含量

Tab.2 Contents of vitamin A of different lipid fractions in liver of Epinephelus drummondhayi μg/100 g

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

由表2可知,中性脂的总维生素A含量最高,磷脂次之,糖脂最低。总脂中维生素A₁的含量高于A₂。维生素A₁在改善夜盲症上有较大的帮助,对于眼睛干涩、视物不清以及皮肤的角质层损伤等症状具有一定的缓解作用。维生素A₂可以在一定程度上缓解由于用眼过度引起的眼疲劳,保证指甲和头发的正常生长;对于皮肤烧伤,维生素A₂也可以起到抑制感染,加快皮肤组织的再生、代谢等作用^[17]。维生素A₁常见于哺乳动物和海水鱼体内,而维生素A₂则多存在于淡水鱼体内。随着研究的深入,人们发现不少海水鱼体中也存在维生素A₂^[4]。不同鱼类肝脏中维生素A种类及含量的不同,与鱼种类、个体大小、自身的食性及饲养管理水平等多方面因素相关^[18]。黄文婷等^[4]检测了9种常见的经济鱼类肝脏中的维生素A,发现除了乌鳢和大口黑鲈外,其他鱼类的肝脏中维生素A的总质量分数均达200 μg/100 g以上,其中海水龙趸石斑鱼肝脏中维生素A的总质量分数最高,达 14.4 mg/100 g,也远高于金枪鱼肝脏的维生素A的质量分数(6.65 mg/100 g)^[16],说明龙趸石斑鱼肝脏可作为获取天然维生素A的优良原料。

2.3 维生素A酯质谱分析

维生素A相关的脂肪酸酯由于其双键的共轭系统而具有强烈的紫外线吸收的特点,因此通常采用反相色谱紫外检测器串联质谱分离和鉴定维生素A酯^[5]。本研究通过质谱分析,对维生素A棕榈酸酯标准品及龙趸石斑鱼肝脏中3种甘油酯成分进行一级质谱测定,得到色谱峰的质谱图,结果见图3。由图3可知:维生素A棕榈酸酯标准品主要在m/z为363处有一个信号峰;中性脂组分在m/z为338和363处各有一个高的信号峰;糖脂组分的高峰出现在m/z为338和357处,而磷脂质荷比主要集中在800附近。对照标准品质谱结果,推测中性脂组分含维生素A棕榈酸酯。维生素A主要以长链维生素A酯的形式存在于动物性来源的食品中^[17]。哺乳动物体内存在的维生素A酯主要是维生素A棕榈酸酯,也有少量维生素A油酸酯、维生素A硬脂酸酯、维生素A肉豆蔻酸酯等其他维生素A酯^[14]。

图3 维生素A棕榈酸酯标准品及龙趸石斑鱼肝脏3种甘油酯组分质谱

Fig.3 Mass spectra of vitamin A palmitate standard and three glyceride fractions in liver of Epinephelus
drummondhayi

2.4 中性脂组分维生素A棕榈酸酯的分离及鉴定

由图2可知,龙趸石斑鱼肝脏的中性脂组分占总脂比例最高,3个组分中中性脂所含维生素A含量最高,因此选择中性脂组分进行分离纯化。采用制备液相进行分离,结果见图4和图5。

图4 中性脂组分的制备液相色谱

Fig.4 Preparative liquid chromatogram of neutral lipid fraction

图5 F3组分质谱

Fig.5 Mass spectra of F3 fraction

由图4可知,中性脂组分分离出了3个峰:F1、F2、F3,对3个峰进行质谱鉴定。3个峰中F3组分具有与维生素A棕榈酸酯标准品一致的信号峰(图5),因此推测F3中含维生素A棕榈酸酯。收集制备液相分离出的F3组分并测得维生素A棕榈酸酯占比68%。顾霄等^[6]同样通过一级质谱对维生素A酯标准品与金枪鱼肝油样品进行分析,根据特征离子检测鉴定得到金枪鱼肝油的多种维生素A酯,其中相对含量较高的是维生素A油酸酯,质量分数为28.6%,维生素A棕榈酸酯,质量分数为13.6%。天然鳕鱼肝油主要含维生素A棕榈酸酯^[6],本研究发现龙趸石斑鱼肝脏所含维生素A也主要是维生素A棕榈酸酯,因此可用于替代鳕鱼肝脏作为开发天然维生素A的优质原料。

2.5 F3组分对HCE-T的毒性分析

为了检测F3组分对HCE-T是否有毒性以及对HCE-T生长的影响,将不同质量浓度的F3组分作用于HCE-T,培养24 h后用CCK-8法进行毒性检测,计算细胞存活率,结果见图6。由图6可知,不同质量浓度的F3组分对细胞存活率的影响无显著差异(P>0.05),都可促进HCE-T增殖。当F3组分质量浓度达到286.00 pg/mL时,细胞存活率显著下降(P<0.05),说明F3组分质量浓度低于286.00 pg/mL时对HCE-T没有明显的毒性作用。参考吴文玉等^[19]在维生素A对糖基化终末产物诱导的HCE-T损伤的作用及机制研究中选择的维生素A的浓度^[19],选取F3质量浓度为28.60、85.80、286.00 pg/mL为低、中、高浓度用于后续干眼症模型实验。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图6 F3组分对HCE-T的毒性分析

Fig.6 Toxicity of F3 fraction on HCE-T

2.6 F3组分对干眼症细胞模型形态及活性的影响

按照实验分组将8组细胞进行培养,在加入CCK-8之前使用倒置显微镜对各组细胞形态进行拍照,结果见图7。

(b)图中箭头指示的区域表示细胞显著减少。

图7 F3组分对干眼症细胞模型形态的影响

Fig.7 Effect of F3 fraction on morphology of xerophthalmia cell model

细胞形态可以作为判定细胞生理功能是否紊乱和样品对细胞是否具有毒性的重要指标之一^[20]。由图7可知,MC组[图7(b)]细胞数量相比于NC组[图7(a)]细胞连接不再紧密,细胞缩小且部分细胞出现透明,并呈悬浮状态,该现象表示细胞已经死亡,且细胞数量出现显著减少,造模成功^[11]。LF3组[图7(c)]、MF3组[图7(d)]的细胞长势较好,和NC细胞一样连接紧密,HF3组[图7(e)]细胞数相较于LF3和MF3组有所减少,出现漂浮现象。LVAP和MVAP组[图7(f)、图7(g)]细胞长势好于HVAP组[图7(h)]。这表明,龙趸石斑鱼肝脏中的天然维生素A棕榈酸酯在适当浓度下对干眼症细胞具有较好的修护作用。王多梅等^[21]的研究亦证实,在动物体内天然维生素A代谢的中间产物全反式维甲酸可以通过上调大鼠角膜上皮细胞中的凋亡抑制蛋白 Bcl-2 以及下调促凋亡抑制蛋白Bax和Caspase-3来抑制角膜细胞损伤愈合过程中细胞凋亡的发生,同时也可有效促进损伤修复后期细胞紧密连接结构的重塑。Zhang等^[22]在苯扎氯铵诱导的小鼠干眼症模型中,发现维生素A可以减少角膜上皮细胞的凋亡,起到治疗干眼症的作用。

将8组细胞进行细胞活性检测,结果见图8。维生素A是通过抑制诱导的JNK和NF-κB的磷酸化而起到提高糖基化终末端产物诱导HCE-T的存活率。在适当浓度的维生素A干预后,苯扎氯铵诱导的干眼症模型细胞存活数量明显增加到空白对照组的10倍左右^[21]。由图8可知:与MC组相比,各组细胞存活率都有不同程度的提高,其中LF3和MF3组显著高于HF3组及LVAP、MVAP和HVAP组(P<0.05);HF3组与LVAP、MVAP和HVAP组之间细胞存活率无显著差异(P>0.05)。F3组分及合成维生素A棕榈酸酯均显著提高了苯扎氯铵诱导的干眼症细胞存活率,降低了细胞凋亡率,且LF3和MF3组细胞活力高于HF3组及LVAP、MVAP和HVAP组。维生素A棕榈酸酯对热、光、空气和湿度敏感,稳定性极差,维生素A棕榈酸酯的稳定性随着甘油三酯浓度的增加而升高^[23]。本研究从中性脂中分离出的F3组分含68%的天然维生素A棕榈酸酯,F3组分中的其他脂质成分的保护作用让维生素A棕榈酸酯更趋于稳定,从而保证了F3组分的保护活性,提高了细胞存活率。刘云凤等^[2]在对天然维生素和合成维生素的活性与标识分析中指出,对维生素 E 和作为维生素 A 源的类胡萝卜素来说,合成的与天然的除在来源上不同之外,它们在化学结构、生物活性及人体的吸收利用上都有差距。天然维生素E在生物活性上优于合成维生素E,天然维生素E的利用率高于合成维生素E,天然维生素E与合成维生素E中异构体的形式和数量决定了其在吸收后的不同的转运效率,进而影响生物学功能的发挥^[24]。维生素A尚未见此类研究,天然维生素A与合成维生素A在空间构象上是否有差异以及其生物活性差异是否与构像差异有关还需要进一步深入研究。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图8 F3组分对干眼症细胞模型活性的影响

Fig.8 Effect of F3 fraction on activity of xerophthalmia cell model

2.7 F3组分对干眼症细胞模型炎症因子的影响

近年来,关于泪腺、泪液以及结膜内炎症细胞和炎症介质等免疫因素的研究发现,炎症是干眼发病的核心因素。干眼症发病期间,白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等多种细胞因子及受体水平在干眼症患者的泪液中明显升高。这些细胞因子刺激角膜、结膜和泪腺上皮细胞分泌更多的炎症介质和细胞因子,从而引起眼部组织的炎症反应和损伤^[25-26]。这些炎症因子可以作为早期识别干眼症严重程度的客观、敏感和可靠的有效指标^[27]。按照实验分组将细胞培养后检测各组细胞内炎症因子,检测结果见图9。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图9 F3组分对干眼症细胞模型IL-6、IL-1β及TNF-α相对表达量的影响

Fig.9 Effect of F3 fraction on relative expression of IL-6、IL-1β and TNF-α in xerophthalmia cell model

干眼症与T细胞介导的炎症有关,在角膜细胞中炎症因子的高表达,使得免疫细胞向角结膜聚集,导致炎症出现^[28]。IL-6是一种多变性的细胞因子,在B细胞中发挥关键作用,诱导浆细胞分化和产生抗体^[29],促进炎症的产生。白细胞介素1(IL-1)又称淋巴细胞活化因子,由激活的单核巨噬细胞和上皮细胞产生。IL-1β 是IL-1的主要活性形式^[30],其会降低受神经调控的泪液分泌功能,降低其神经递质的释放,从而导致干眼症。IL-1β在多种慢性炎症中有表达,是机体的重要免疫介质。TNF-α是由单核巨噬细胞分泌的一种多向性细胞因子,是干眼炎症反应中活跃的炎症因子,其促进产生泪腺组织中的胶原酶,而胶原酶会破坏腺泡结构,这一现象易诱发眼部炎症^[31]。干眼患者泪液中 TNF-α 的含量高于正常人,且泪液中TNF-α的含量与角膜上皮的损伤程度呈正相关^[32-33]。在一定程度上,TNF-α干预泪腺上皮细胞更具备干眼模型的特征^[11]。

在图9中,对于IL-6相对表达量,MC组相对于NC组显著上升,F3组及合成维生素A棕榈酸酯组相对于MC组表达量都显著下降,其中LF3、MF3组及LVAP组显著高于MVAP、HVAP组(P<0.05)。对于IL-1β相对表达量,MC组相对于NC组出现显著上升,3个剂量的F3组与LVAP、MVAP组无显著差异,NC组与MVAP、HVAP组无显著差异(P>0.05)。在TNF-α相对表达量中,3个剂量的F3组及合成维生素A棕榈酸酯组均显著低于MC组,其中LF3组显著低于LVAP和HVAP组,3个剂量的F3组显著低于LVAP组(P<0.05),MF3和HF3组与合成维生素A棕榈酸酯组无显著差异(P>0.05)。Li等^[34]探讨了虾青素在高渗诱导的体内外干眼模型中的抑炎作用及其作用机制,结果发现,虾青素能通过下调干眼症模型中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)和炎性细胞因子TNF-α、IL-1β的表达来抑制炎症。在本研究中,F3组及维生素A棕榈酸酯组均能下调IL-6及TNF-α的表达,缓解干眼病导致的炎症。Rolando等^[35]研究表明,患者在干眼症的最早阶段,眼睛仍然是湿润的,几乎没有眼表损伤的迹象,但结膜上皮的炎症标志物的表达高于正常人。到目前为止,干眼症与炎症系统激活之间的确切关系还没有被阐明。但可以肯定的是,抗炎治疗可以减少干眼症的症状^[36]。不同干眼症模型及培养条件导致的研究结果不一致,维生素A对干眼症的影响机制还有待进一步探究。

龙趸石斑鱼肝脏中99.57%的维生素A以结合态存在,主要是维生素A棕榈酸酯,且在肝脏中性脂中含量最多。从龙趸石斑鱼肝脏中性脂中分离纯化得到含天然维生素A棕榈酸酯的F3组分,当F3质量浓度高于286.00 pg/mL时,HCE-T细胞存活率显著下降。F3组分及合成维生素A棕榈酸酯均能显著提高苯扎氯铵诱导的干眼症细胞存活率,减少细胞凋亡,且低、中剂量的F3组细胞存活率优于合成维生素A棕榈酸酯组。F3组分及合成维生素A棕榈酸酯均能下调苯扎氯铵诱导的干眼症细胞模型中IL-6及TNF-α的基因表达,缓解干眼病导致的炎症。本研究旨在探索天然维生素A棕榈酸酯与合成维生素A棕榈酸酯生理活性之间的差异,为龙趸石斑鱼肝脏中天然维生素A资源的开发提供理论参考。

制作：路旭东

编辑：张逸群、李宁

审核：叶红波