东北农业大学侯俊财教授等：LuxS/AI-2群体感应系统对植物乳杆菌抵御环境胁迫的作用

群体感应(quorum sensing,QS)是一种依赖细胞密度的细菌通信系统,通过种内或种间的信号分子调节细菌行为^[1]。细菌生长阶段分泌产生的可溶性自诱导因子(autoinducers,AIs)自由扩散到周围环境内,并监控群体密度及调节细菌的生长行为和功能^[2]。研究发现,哈氏弧菌(Vibrio harveyi)可分泌信号分子AI-1(autoinducer-1,AI-1)和AI-2(autoin-ducer-2,AI-2)^[3]。在革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌中普遍存在的群体感应系统为信号分子AI-2介导的LuxS/AI-2群体感应系统^[4-5]。

益生乳杆菌因其长期的安全使用历史及调节肠道菌群、抑制致病菌、预防感染和腹泻、改善炎症性肠病和调节免疫系统等潜在功能而受到广泛关注^[6]。其中,植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,L. plantarum)是农业和食品工业中常用的益生乳杆菌,其抵御加工、贮藏及胃肠道等环境胁迫的能力是其在食品工业中应用的前提条件^[7]。乳杆菌可通过LuxS/AI-2群体感应系统介导其益生功效的发挥,如参与生物膜的形成、细胞黏附的调控、抑菌作用的发挥及环境胁迫耐受性存活等^[8-10]。

目前关于不同种类环境胁迫下植物乳杆菌LuxS/AI-2群体感应系统全面报道的信息有限,阐明LuxS/AI-2群体感应系统在植物乳杆菌中的调控机制对开发稳定、高效的益生菌产品具有重要的理论意义和应用价值。因此,本研究拟通过解析不同初始pH值、渗透压、温度及营养环境胁迫下植物乳杆菌1.0328菌密度及代谢产酸情况,分析环境胁迫下LuxS/AI-2群体感应信号分子AI-2活性随时间的变化规律,综合考察环境胁迫下植物乳杆菌LuxS/AI-2群体感应系统关键基因luxS及pfs表达水平上的变化规律,探讨LuxS/AI-2群体感应系统调控植物乳杆菌抵御环境胁迫的作用机制,希望为进一步改善益生乳杆菌在食品中实际应用的有效性提供依据。

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌KLDS 1.0328,分离筛选于黑龙江省传统发酵泡菜中,并保藏在东北农业大学乳品科学教育部重点实验室;哈氏弧菌(Vibrio harveyi,V. harveyi)BB 170,中国农业科学院上海兽医研究所。MRS培养基,北京奥博星生物技术有限责任公司;海生菌2216E培养基,青岛海博生物技术有限公司;RNAprep Pure培养细菌总RNA试剂盒,北京天根生化科技有限公司;Prime Script^® RT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒、SYBR^®Premix Ex Taq^TM试剂盒,宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 仪器与设备

DHP-9082型电热恒温培养箱,上海一恒科技有限公司;Step One PlusTM型实时荧光定量PCR仪,美国Life Technologies公司;LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;H1750R型台式高速冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;SpectraMax reg iD3型多功能酶标仪,上海美谷分子仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基配制及菌种的活化

AB培养基配制:MgSO₄ 12.3 g/L、NaCl 17.5 g/L、不含维生素的酪蛋白氨基酸2 g/L,使用KOH溶液将pH值调至7.6,121 ℃高压灭菌15 min,冷却至室温后添加无菌K₂HPO₄(1 mol/L)10 mL、无菌L-精氨酸(0.1 mol/L)10 mL及无菌甘油(质量分数50%)20 mL。

将植物乳杆菌KLDS 1.0328以体积分数2%的接种量接种于MRS培养基中,37 ℃下培养24 h,并连续活化3次以恢复菌种活力。哈氏弧菌BB 170以体积分数2%的接种量接种到无菌海生菌2216E培养基内并以150 r/min在30 ℃条件下有氧培养16 h,活化3代后以体积分数2%的接种量接种于无菌AB液体培养基内备用。

1.3.2 菌体密度的测定及无细胞发酵上清液的制备

以菌液在600 nm波长下的吸光度OD₆₀₀表示菌体密度。取待测菌液于4 ℃、4 000 r/min离心10 min,采用2 mol/L NaOH将上清液的pH值调节至6.5。用0.22 μm的滤膜过滤得到排酸后的无细胞发酵上清液(cell-free supernatant,CFS)。将哈氏弧菌BB 170以2%的接种量接种到无菌AB培养基内,150 r/min、30 ℃有氧培养16 h,4 ℃、4 000 r/min离心10 min,以0.22 μm滤膜过滤所得的上清液为阳性对照;AB培养基以0.22 μm滤膜过滤为阴性对照;将MRS培养基以0.22 μm滤膜过滤为介质对照。所有样品-80 ℃贮存备用。

1.3.3 信号分子AI-2活性的测定

将已活化好的哈氏弧菌BB 170以2%的接种量接种到无菌AB培养基内,在摇床175 r/min、30 ℃条件下有氧培养16 h,以无菌AB培养基将哈氏弧菌BB 170菌液按体积比1∶5 000稀释。将待测样品、阳性对照样品、阴性对照样品以及介质对照样品分别与经过了5 000倍稀释的哈氏弧菌BB 170菌液,按体积比1∶100混合后于175 r/min、30 ℃下共孵育^[11]。当AB培养基荧光强度最小时,于490 nm波长化学发光模式下测定荧光强度,以相对荧光强度表示信号分子AI-2的活性。

1.3.4 LuxS/AI-2群体感应系统关键基因转录水平测定

通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)内已有的植物乳杆菌luxS、pfs基因对应的全序列,以16S rRNA基因为内参基因,Primer Premier 5.0引物设计软件设计引物,经上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列见表1。使用总RNA试剂盒提取菌体总RNA。除去基因组DNA,以总RNA为模板,使用逆转录试剂盒合成cDNA。以逆转录cDNA为模板,参考SYBR^®Premix Ex Taq^TM试剂盒,配制实时荧光定量PCR反应体系20 μL。PCR反应参数:95 ℃预变性30 s,95 ℃、5 s,60 ℃、34 s,共计40个循环。采用2^-ΔΔCt法分析LuxS/AI-2群体感应系统关键基因luxS及pfs的转录情况。

表1 引物序列信息

Tab.1 Primer sequences information

1.3.5 LuxS/AI-2群体感应系统对植物乳杆菌抵御环境胁迫能力的测定

1)酸减胁迫。分别使用1 mol/L HCl或NaOH将MRS培养基调整至初始pH值分别为3.5、5.0、8.0、9.0,初始pH值为6.4±0.2的原MRS培养基为对照组。2)渗透压胁迫。配制添加质量分数1.5%、3.0%、6.0% 的NaCl及3.0% NaCl+3.0% KCl的MRS培养基,未添加盐的MRS培养基为对照组。3)温度胁迫。分别在25、30、37、45、50 ℃下厌氧培养24 h,培养温度37 ℃为对照组。4)营养胁迫。以质量浓度0.85 g/100 mL的无菌生理盐水将MRS培养基分别稀释至体积分数为20%、40%、60%、80%,原MRS培养基为对照组。每隔4 h测定菌液在600 nm下的吸光度及可滴定酸度,并制备CFS测定AI-2信号分子活性,培养8 h时分析luxS及pfs的转录差异。

1.4 数据处理

所有实验均重复3次,数据以平均值±标准偏差表示。采用SPSS 26.0软件的单因素方差分析及Tukey检验对数据进行分析,P<0.05代表数据间存在显著性差异。

2.1 酸碱胁迫对菌体代谢及群体感应系统的影响

图1显示了酸碱胁迫对于植物乳杆菌KLDS 1.0328菌体密度、产酸、产AI-2信号分子及群体感应相关基因转录的影响。由图1(a)可知,当面临初始pH值为3.5的环境胁迫时,植物乳杆菌KLDS 1.0328可较为缓慢地生长但容易死亡,而初始pH值为8.0的实验组在培养了16～20 h时的菌体密度显著高于对照组及其他pH值组(P<0.05),这是由于较高的初始pH值延缓了乳酸导致的pH值降低和酸胁迫。由图1(b)可知,pH 3.5及pH 9.0组植物乳杆菌KLDS 1.0328的生长及产酸性能均受到明显抑制。对于初始pH值为9.0的碱胁迫,菌体的生长遭到抑制,培养4～12 h时,相同单位量的菌体信号分子AI-2的释放相较于对照组受到明显抑制,而12 h后相对荧光强度则迅速增高,这可能是因为菌体代谢产生的有机酸进一步中和了培养基内的碱[图1(c)]。由图1(d)可知,与pH值为6.4的对照组相比,pH值为3.5的酸胁迫下luxS及pfs基因的转录水平均达到最高(P<0.05)。此外,当初始pH值为8.0及9.0时,植物乳杆菌KLDS 1.0328 luxS基因受到碱胁迫的诱导作用,其转录水平均显著上调(P<0.05)。在pH值为3.5的重度酸胁迫下,信号分子AI-2诱导的相对荧光强度显著增加,这意味着信号分子AI-2的调控可能主要受到强酸的刺激。相似地,曾有研究报道了在pH值为3.5的条件下,发酵乳杆菌易受到胁迫并通过群体感应系统以生物被膜形成率更高的形式存活^[12]。

图(a)～(c)中不同小写字母代表同一胁迫处理组不同培养时间之间数据差异显著(P<0.05),不同大写字母代表相同培养时间不同胁迫处理组数据差异显著(P<0.05);图(d)中不同小写字母代表不同胁迫处理组luxS基因转录水平数据差异显著(P<0.05),不同大写字母代表不同胁迫处理组pfs基因转录水平数据差异显著(P<0.05)。

图1 不同pH条件值下植物乳杆菌菌体密度、产酸、产AI-2信号分子及群体感应相关基因转录的变化
Fig.1 Changes of cell density, acid production, AI-2 production and transcription of quorum
sensing-related genes of L. plantarum at different pH values

2.2 渗透压胁迫对菌体代谢及群体感应系统的影响

不同渗透压胁迫对于植物乳杆菌KLDS 1.0328菌体密度、产酸、产AI-2信号分子及群体感应相关基因转录的影响见图2。由图2(a)可知,随着盐的质量分数增加带来培养基渗透压逐渐增大,植物乳杆菌KLDS 1.0328的最大菌体密度逐渐降低,且各处理组均显著低于未经胁迫的对照组(P<0.05)。在较高的总盐质量分数(6.0%)下,菌体的生长缓慢。Gandhi和Shah^[13]也曾揭示了,质量分数5.0%的NaCl可引起益生菌的细胞酯酶活性等代谢活性受到抑制,损伤细胞膜完整性,甚至导致细胞死亡。前期研究发现,当NaCl部分被KCl替代时,植物乳杆菌菌体的损伤及黏附能力均存在一定的改善^[7]。因此,本研究采用3.0% NaCl+3.0% KCl替代6.0% NaCl,旨在进一步探索LuxS/AI-2群体感应系统在植物乳杆菌KLDS 1.0328抵御不同种类高渗透压胁迫下的潜在作用。研究结果表明,采用KCl部分替代NaCl,与只添加NaCl的MRS培养基相比,未显著提高可滴定酸度[图2(b)],而在培养12～20 h时显著提高了菌体密度(P<0.05),这表明了KCl在高渗环境中对菌体具有潜在的保护作用^[14]。由图2(c)可知,处于较强渗透压胁迫下,信号分子AI-2的活性明显受到抑制,且KCl替代渗透压胁迫组中信号分子AI-2活性比未替代前更强。Lin等^[15]曾证实,清酒乳杆菌及植物乳杆菌遭受发酵相关高浓度硝酸盐胁迫时,LuxS/AI-2群体感应系统luxS基因的转录显著增加,表明luxS介导的群体感应系统通过AI-2活性的变化参与了乳杆菌的胁迫应激反应,并在高渗胁迫适应及微生物演替中起重要调控作用。此外,当菌体处于质量分数3.0%的NaCl及以上的渗透压胁迫时,基因luxS与pfs的转录水平均显著上调[图2(d)]。

图(a)～(c)中不同小写字母代表同一胁迫处理组不同培养时间之间数据差异显著(P<0.05),不同大写字母代表相同培养时间不同胁迫处理组数据差异显著(P<0.05);图(d)中不同小写字母代表不同胁迫处理组luxS基因转录水平数据差异显著(P<0.05),不同大写字母代表不同胁迫处理组pfs基因转录水平数据差异显著(P<0.05)。

图2 不同渗透压胁迫下植物乳杆菌菌体密度、产酸、产AI-2信号分子及群体感应相关基因转录的变化
Fig.2 Changes of cell density, acid production, AI-2 production and transcription of quorum
sensing-related genes of L. plantarum at different osmotic stress

2.3 温度胁迫对菌体代谢及群体感应系统的影响

温度胁迫对于植物乳杆菌KLDS 1.0328菌体密度、产酸、产AI-2信号分子及群体感应相关基因转录的影响见图3。由图3(a)可知,低于最适温度的 25 ℃处理能够导致菌体的生长及代谢受抑制,而45 ℃轻度高温胁迫在培养初期可促进菌体的增殖及产酸代谢,重度高温胁迫则会对菌体生长代谢造成不利影响。由图3(b)可知,于37 ℃下培养植物乳杆菌KLDS 1.0328的产酸能力较强,而处于25 ℃及50 ℃时,菌体的产酸能力明显受到抑制。轻度低温胁迫稳定期及轻度高温胁迫培养初期,信号分子AI-2活性显著提高;更强程度的温度胁迫下,信号分子AI-2活性受到显著抑制[图3(c)]。低温胁迫诱导促使luxS及pfs基因的转录水平显著上调,而pfs基因的转录受高温胁迫的影响较小[图3(d)]。这与Gu等^[3]的研究结果相似,发酵乳杆菌2-1的群体感应系统相关基因转录在较低温度(23、30 ℃)胁迫下显著上调,而在44 ℃下基因的转录与未胁迫相比无显著差异(P>0.05)。曾有研究报道了温度胁迫适应诱发的交叉保护能够提升菌体面临异种环境胁迫时的存活率^[16-17]。此外,Liu等^[18]发现过表达luxS基因可提高类植物乳杆菌L-ZS9群体感应信号分子AI-2的产量,luxS的过表达改善了菌株的耐热性及胆盐耐受性。

图(a)～(c)中不同小写字母代表同一胁迫处理组不同培养时间之间数据差异显著(P<0.05),不同大写字母代表相同培养时间不同胁迫处理组数据差异显著(P<0.05);图(d)中不同小写字母代表不同胁迫处理组luxS基因转录水平数据差异显著(P<0.05),不同大写字母代表不同胁迫处理组pfs基因转录水平数据差异显著(P<0.05)。

图3 不同温度胁迫条件下植物乳杆菌菌体密度、产酸、产AI-2信号分子及群体感应相关基因转录的变化
Fig.3 Changes of cell density, acid production, AI-2 production and transcription of quorum
sensing-related genes of L. plantarum at different temperature stress

2.4 营养胁迫对菌体代谢及群体感应系统的影响

图4显示了营养胁迫对于植物乳杆菌KLDS 1.0328菌体密度、产酸、产AI-2信号分子及群体感应相关基因转录的影响。随着营养缺乏胁迫程度的提高,植物乳杆菌KLDS 1.0328的生长及产酸性能均受到明显抑制[图4(a)和图4(b)]。同时,由图4(c)可知,营养胁迫的程度越强,诱导产生的信号分子AI-2越多。此外,更为严酷的营养胁迫提高了luxS及pfs基因的转录水平[图4(d)]。曾有研究证实了植物乳杆菌B21的菌体形态和细胞膜脂肪酸组成及含量的改变可作为其适应缺乏葡萄糖及吐温-80营养胁迫的有效策略^[19]。植物乳杆菌KLDS 1.0328信号分子AI-2的活性变化与luxS及pfs基因的转录水平变化并不是完全对应的,这可能是由于转录水平测定的为8 h的数据,所以转录的数据与不同培养时间下信号分子AI-2的活性不符。此外,由于luxS及pfs基因编码的蛋白质不但能够介入信号分子AI-2的生物合成路径,还可能在环境胁迫下介入菌体的其他代谢通路,并以胁迫应激蛋白的形式在恶劣的环境条件下诱导表达的进化。

图(a)～(c)中不同小写字母代表同一胁迫处理组不同培养时间之间数据差异显著(P<0.05),不同大写字母代表相同培养时间不同胁迫处理组数据差异显著(P<0.05);图(d)中不同小写字母代表不同胁迫处理组luxS基因转录水平数据差异显著(P<0.05),不同大写字母代表不同胁迫处理组pfs基因转录水平数据差异显著(P<0.05)。

图4 不同营养胁迫条件下植物乳杆菌菌体密度、产酸、产AI-2信号分子及群体感应相关基因转录的变化
Fig.4 Changes of cell density, acid production, AI-2 production and transcription of quorum
sensing-related genes of L. plantarum at different nutrient stress

本研究对酸碱、渗透压、温度及营养匮乏胁迫条件下植物乳杆菌KLDS 1.0328的LuxS/AI-2群体感应系统进行了分析,信号分子AI-2分泌的抑制与初始pH值为8.0、9.0的碱胁迫,25 ℃低温、50 ℃高温,质量分数6.0% NaCl、3.0% NaCl+3.0% KCl的高渗透压胁迫相关;而AI-2活性的增强可由初始pH值为3.5、5.0的酸胁迫,45 ℃高温,营养物质稀释至体积分数为20%、40%、60%的营养胁迫引起。经初始pH值为3.5、9.0,25、30 ℃低温,6.0%NaCl及3.0% NaCl+3.0% KCl的高渗透压以及20%的MRS培养基营养胁迫处理后,luxS及pfs的转录均达较高水平。因此,不同环境胁迫条件下LuxS/AI-2群体感应系统存在不同程度的变化,并参与了该菌株的抗逆过程。植物乳杆菌LuxS/AI-2群体感应系统的增强,可作为其抵御多种环境胁迫策略的新起点。然而,目前乳杆菌中LuxS/AI-2群体感应系统调控路径的揭示仍是该研究领域面临的重要挑战。应在此基础上采用高通量技术进一步在基因转录、蛋白质表达以及代谢组学等现代分子生物学层面分析及验证环境胁迫下菌体的适应机制,系统分析菌体胁迫应答的机理。研究结果旨在为阐明LuxS/AI-2群体感应系统改善益生乳杆菌对恶劣环境胁迫的抗逆机制,并为促进益生菌产品的开发提供理论依据。

制作：路旭东

编辑：张逸群、李宁

审核：叶红波