四川轻化工大学罗惠波教授等：2种浓香型白酒大曲中微生物群落结构及功能研究

白酒是中国的国酒,也是世界6大蒸馏酒之一,拥有悠久的历史文化传承,浓香型白酒是中国白酒最重要的香型之一。“曲乃酒之骨”很好地诠释了酒曲对白酒酿造的重要性。大曲是以小麦为主要原料,经破碎、加水拌料、压成砖块状的曲坯后,再在人工控制的温度和湿度下培养发酵、风干贮存而成,是用于白酒酿造的糖化发酵剂,一般为砖形的块状物。大曲富含淀粉分解与乙醇发酵的各种微生物,如霉菌、细菌等。大曲发酵是微生物富集、培养和筛选的过程,发酵过程的环境条件直接影响微生物群落形成。温度、酸度、O₂、CO₂、湿度、水分等环境条件都会影响大曲发酵,其中温度和酸度是细菌群落演替的主要驱动因素,而温度和湿度是影响大曲真菌群落演替的最重要因素^[1]。根据发酵过程的顶火温度,大曲可以分为高温大曲、中高温大曲、中温大曲和低温大曲,其中中高温大曲和中温大曲都是浓香型白酒主要的生产用曲^[2]。早期的浓香型白酒生产采用中温大曲,随着对酒的品质和风味的深入研究,目前,浓香型白酒的生产大多已改为中高温大曲。由于对2种大曲酿造制得的浓香型白酒风味存在的差异性及其机制缺乏深度认知,选用中温大曲还是中高温大曲,已成为行业亟须解决的问题。

目前,中温大曲和中高温大曲都是采用小麦为原料。在同一制曲厂的2种大曲,仅发酵过程的最高温度(顶火温度)的控制存在差异:中温大曲的顶火温度为 50～55 ℃,中高温大曲的顶火温度为 55～60 ℃。顶火温度是大曲发酵过程中微生物的重要筛选条件,大曲顶火温度的不同导致大曲中微生物群落结构的差异,同时由于微生物的差异导致其代谢的酶种类和含量存在差异,而影响大曲的发酵性能^[3]。如高温大曲中的耐高温微生物(芽孢杆菌和高温放线菌等)增加将会提高大曲的蛋白酶活力;低温大曲和中温大曲中的霉菌和酵母较多,其糖化和发酵能力高于其他大曲^[4]。对不同地区的浓香型白酒生产用大曲的研究表明,其理化指标和微生物群落存在差异,但是优势菌属较为相似,如细菌为芽孢杆菌属、不动杆菌属、乳杆菌属等23个优势菌属,真菌为嗜热子囊菌属、曲霉属、假丝酵母属等12个优势菌属^[5]。对制曲过程微生物演替规律的研究表明,真菌在发酵早期活跃,细菌在发酵后期较为活跃^[6]。目前,关于不同大曲的理化指标和微生物群落结构都有相关研究,特别是高通量测序技术对大曲微生物群落结构有更加深入的解析,但是缺乏对相同原料制备的中高温大曲和中温大曲的理化指标、酶活力指标和微生物群落的对比研究。

本研究选用典型浓香型白酒企业生产的中高温大曲和中温大曲,采用测序技术对2种大曲中微生物群落结构进行解析,结合理化指标和酶活力指标对2种大曲的差异性进行分析,希望找到2种浓香型白酒生产用大曲的潜在酿造特性的差异,以期为浓香型白酒生产用大曲的选择提供理论支撑。

1.1 材料与试剂

大曲样品取自四川宜宾某大型浓香型白酒厂制曲车间,在大曲贮存结束的时候按照贮存堆的不同位置进行取样。采样点的选取方法见图1,每批次样品取15个采样点,每个采样点为1～2块大曲,将每个采样点的15～30块大曲粉碎混合均匀,制备为1个样品。每个样品分为2份,一份置于4 ℃条件下用于理化指标和酶活力指标的检测,一份置于-80 ℃条件下用于微生物群落分析。

图1 大曲样品的采集

Fig.1 Collection of Daqu samples

中高温大曲共计4个批次的样品(编号为ZGW1、ZGW2、ZGW3、ZGW4);中温大曲共计5个批次的样品(编号为ZW1、ZW2、ZW3、ZW4、ZW5)。不同批次样品来源于该白酒厂不同制曲车间的曲堆。

E.Z.N.A.^®soil型DNA提取试剂盒,美国Omega Bio-Tek公司;氢氧化钠、碘化汞、碘化钾、酒石酸钾钠、氯化铵、葡萄糖、盐酸、硫酸铜、磷酸二氢钾、乙酸、柠檬酸、福林试剂、次氯酸钠、碳酸钠、三氯乙酸、乙酸钠、硫酸、高锰酸钾等,分析纯,成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2400型紫外分光光度计,上海尤尼柯仪器有限公司;5430R型高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;C1000型PCR仪、PowerPac型电泳仪、Gel Doc RX型凝胶成像仪,美国Bio Rad公司;NanoDrop2000型DNA含量测定仪,美国Thermo公司。

1.3 实验方法

1.3.1 大曲理化指标和酶活力指标的测定

大曲理化指标的测定。参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》,测定水分、酸度、淀粉含量以及还原糖含量;取样时记录样品的顶火温度。

大曲酶活力指标的测定。参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》,测定糖化力、液化力、发酵力、酯化力;参考福林酚法^[7],测定蛋白酶活力。

1.3.2 大曲中微生物DNA的提取及PCR扩增

取大曲样品粉末10 g,添加pH值7.4的磷酸缓冲液30 mL,充分振荡混匀,然后800 r/min离心2 min,收集上层菌液。将剩余沉淀再次添加20 mL磷酸缓冲液进行洗菌,将两次上层菌液合并,再用 12 000 r/min 离心10 min,收集菌体。

将收集的菌体按照DNA提取试剂盒的方法进行提取分析。利用DNA含量测定仪检测DNA浓度和纯度,260/280的检测结果在1.8左右(1.7～1.9),同时用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA,根据电泳DNA条带亮度和260/280比值判断其质量。

采用ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)引物对真菌ITS基因进行PCR扩增,扩增程序为95 ℃预变性3min,30个循环(95 ℃变性30 s,50 ℃退火 30 s,72 ℃延伸1 min),最后72 ℃延伸10 min^[8]。

采用27F(5′-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-RGYTACCTTGTTACGACTT-3′)引物对细菌16S rRNA基因进行PCR扩增,扩增程序为95 ℃预变性3 min,30个循环(95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min),最后72 ℃延伸10 min^[9]。

扩增体系为25 μL体系。5 μL 5×FastPfu缓冲液,2.5 μL 2.5 mmol dNTPs,1 μL引物(5 μmol),0.5 μL FastPfu聚合酶;10 ng/μL DNA模板,补超纯H₂O至25 μL。每个样本3次重复,将同一样本的PCR产物混合后用质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测,将检测合格的PCR产物用于后续测序分析。

1.3.3 大曲中微生物的基因测序及数据注释

将扩增的基因片段利用Pacbio Sequel Ⅱ System进行测序(由上海美吉生物医药科技有限公司完成),使用Trimmomatic对原始fastq文件进行质量过滤,并使用FLASH软件对过滤后的序列进行筛选,按照标签和引物对样品序列进行拆分,去除有歧义的reads。获得的有效序列利用Qiime2软件的DADA2插件进行ASV聚类,可以被认为是100%的相似度的操作分类单位(operational taxonomic units,OTU);然后利用Qiime2 对每个OTU进行比对注释,注释方法为classify-Naive Bayes,真菌选用Unite数据库(http:∥unite.ut.ee/index.php),细菌选用Silva数据库(http:∥www.arb-silva.de),置信度设置为0.7。

1.4 数据处理

采用R Studio软件对大曲理化指标和酶活力指标进行主成分分析(principal component analysis,PCA),t检验判别2组大曲的理化指标差异的显著性,GraphPad Prism 8绘制箱线图展示指标间差异。利用Qiime2软件基于OTU水平计算α多样性指数,基于Bray-Curtis不相似矩阵的主坐标分析(principal coordinate analysis,PCoA)进行β多样性分析。利用LEfSe多级物种差异判别分析法寻找差异性物种,主要是通过非参数因子Kruskal-Wallis秩和检验实现。利用Venn图和Bar图展示微生物群落组成,利用PCoA和LEfSe多级物种差异判别分析展示样品微生物群落结构差异。PICRUSt2可基于16S rRNA和ITS测序数据进行微生物群落功能预测,利用R Studio软件绘制气泡图展示预测结果中碳代谢和氮代谢的基因丰度。

2.1 2种大曲的理化指标和酶活力指标的差异

理化指标和酶活力指标是评价大曲品控和分级的重要判断依据,研究主要对2种大曲的5个理化指标(水分、酸度、还原糖含量、淀粉含量、顶火温度)和5个酶活力指标(糖化力、液化力、酯化力、发酵力和蛋白酶活力)进行测定。

利用2种大曲的理化指标和酶活力指标构建PCA模型,见图2。PC1贡献率为92.35%,PC2贡献率为6.32%,PC3贡献率为1.25%,前2个PC累计贡献率达到98%以上。由图2可知,ZGW和ZW样品之间距离较远,组间差异明显,说明这2种大曲的理化指标和酶活力指标存在差异性。为了进一步认识2种大曲在理化指标和酶活力指标间的差异,绘制箱线图,并进行显著性检验,见图3。由图3可知,2种大曲间有4个显著差异性指标(P<0.05)、2个极显著差异性指标(P<0.01);ZGW组的酸度、顶火温度和蛋白酶活力显著高于ZW组(P<0.05),这体现出酶活力层面ZGW组氮代谢能力强于ZW;ZW的液化力显著高于ZGW组(P<0.05),ZW组的糖化力和发酵力极显著高于ZGW组(P<0.01),这也从酶活力层面体现出ZW组的碳代谢能力强于ZGW组。大曲的水分是控制性指标,一般都控制在10%左右,2种大曲的水分没有显著性差异。ZGW与ZW的淀粉含量和还原糖含量无显著性差异,可能是由于大曲都是以淀粉质较高的小麦为原料,2个指标都不是限制性指标。2种大曲的酯化力没有显著性差异。

图2 2种大曲的理化指标和酶活力指标的主成分分析

Fig.2 Principal component analysis of physicochemical and enzyme activity indexes of 2 types of Daqu

图3 2种大曲的理化指标和酶活力指标

Fig.3 Physicochemical and enzyme activity indexes of 2 types of Daqu

2.2 2种大曲的真菌群落结构差异

对2种大曲的真菌群落结构进行分析,见图4。由图4(a)可知,2种大曲真菌共计检出72个种,其中共有的种46个,占据63.89%,中高温大曲独有的真菌种为17,中温大曲独有的真菌种为9个。检验2种大曲基于真菌物种水平群落差异,进行Bray curtis距离算法的PCoA,由图4(b)可知,PC1贡献率为67.68%,PC2的贡献率为18.63%,较好地将ZGW和ZW组样品分开。同时组间差异性检验采用ANOSIM,R=0.90,P<0.05,说明2种大曲的真菌群落结构存在显著的差异性。由图4(c)可知,主要的真菌优势菌种有20个(相对丰度>1.5%),其中ZGW组中相对丰度最高的是橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus),平均相对丰度达到24.64%,其次是地霉双足囊菌(Dipodascus geotrichum,13.39%)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus,8.04%)、新丝孢酵母(Cutaneotrichosporon dermatis,4.82%)和阿姆斯特丹曲霉(Aspergillus amstelodami,3.12%)等;在ZW组中主要是酵母占比较高,其中热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)占比达到40.00%,其次是奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri,12.80%)、丝孢酵母(Trichosporon coremiiforme,10.98%)和东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis,8.43%)等。为了进一步找到2种大曲的差异性菌种,进行了基于种水平的LEfSe分析,见图4(d)。共计找到了14个种级水平的差异性真菌,其中ZGW组的差异性物种是T. aurantiacus、D. geotrichum、W. anomalus、C. dermatis、扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、Wallemia mellicola、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)、费比恩塞伯林德纳氏酵母(Cyberlindnera fabianii);ZW组的差异性物种是C. tropicalis、K. ohmeri、T. coremiiforme、I. orientalis和阿氏丝孢酵母(Trichosporon asahii)。中高温大曲和中温大曲在真菌种水平上共有菌种多于差异性菌株,但是群落结构存在较大差异性,这种差异性可能导致2种大曲在酿造性能上有一定差异。

图4 2种大曲的真菌群落结构分析

Fig.4 Analysis of fungal community structure of 2 types of Daqu

2.3 2种大曲的细菌群落结构差异

对2种大曲的细菌群落结构进行分析,见图5。由图5(a)可知,2种大曲细菌共计检出52个种,其中共有的种26个,占据50.00%,中高温大曲独有的种为12个,中温大曲独有的种为14个。利用Bray curtis距离算法的PCoA对2种大曲细菌菌落结构进行分析,由图5(b)可知PC1贡献率为18.01%,PC2的贡献率为13.62%,较好地将ZGW和ZW组样品分开。同时组间差异性检验采用ANOSIM,R=0.887 5,P<0.05,说明2种大曲的细菌群落结构存在显著的差异性。由图5(c)可知,主要的细菌优势菌种有20个(相对丰度>1.5%),其中ZGW组中相对丰度最高的是约翰逊不动杆菌(Acinetobacter johnsonii XBB1),平均相对丰度达到32.49%,其次是清酒乳杆菌(Lactobacillus sakie,16.80%)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida,10.68%)、路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii,9.53%)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens,6.93%)和副肠膜状魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides,3.01%)等;在ZW组中清酒乳杆菌相对丰度达到39.32%,其次是约翰逊不动杆菌,占比达到18.45%,其他优势菌种还包括屎肠球菌(Enterococcus faecium,13.00%)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae P101,6.44%)和路氏肠杆菌(E. ludwigii,4.13%)等。为了进一步找到2种大曲细菌的差异性菌种,使用LEfSe方法分析找到了9个种级水平的差异性细菌,见图5(d)。其中ZGW组的优势差异性物种是A. johnsonii XBB1、P. putida、E. ludwigii 和B. amyloliquefaciens;ZW组的优势差异性物种是L. sakie、Lactobacter sp TS3、E. cloacae P101、E. faecium和成团泛菌(Pantoea agglomerans)。中高温大曲和中温大曲在细菌种水平上有较多差异性菌株,同时许多共有菌种在相对丰度上也存在较大差异,这都说明2种大曲细菌群落结构存在较大差异,这可能也是引起2种大曲酿造性能差异的原因。

图5 2种大曲的细菌群落结构分析

Fig.5 Analysis of bacterial community structure of 2 types of Daqu

2.4 2种大曲的潜在功能差异预测

碳代谢和氮代谢是白酒香味物质形成的重要路径,为了找到2种大曲在碳氮代谢中的潜在功能差异,基于16S rRNA和ITS的测序数据,利用PICRUSt2进行2种大曲碳氮代谢主要路径的功能预测,构建了主要的代谢路径,见图6;对路径中的主要酶的丰度采用气泡图进行展示,见图7。由图6可知,碳代谢路径中,淀粉被分解成为葡萄糖,经过EMP途径(Embden Meyerhof Parnas pathway)转化为丙酮酸,丙酮酸经过酵解产生乳酸、发酵产生乙醇,这2个反应都是在无氧状态下进行的。丙酮酸还能在丙酮酸脱羧酶系(主要是3种酶、6种辅因子)的作用下脱掉1分子CO₂,生成乙酰-CoA。乙酰-CoA在电子供体和电子受体都存在的情况下,进行逆β-氧化反应,进行碳链的延伸,生成更长链的酸或醇。同时碳代谢为含氮类化合物的合成提供碳骨架,如通过丙酮酸经过多步反应可以生成乙偶姻。从氮代谢的路径来说,蛋白质在蛋白酶的作用下分解成氨基酸,氨基酸通过转氨基和脱氨基的反应生成游离氨,这游离氨和乙偶姻在热化学反应的推动下形成吡嗪类物质。在淀粉转化为葡萄糖的过程中,α-淀粉酶(EC3.2.1.1)和葡糖苷酶(EC3.2.1.3)是潜在的作用酶,这2种酶在ZW组中丰度极显著高于ZGW组(P<0.01);在葡萄糖转化为丙酮酸的过程中主要有5个酶,这些酶的丰度在2种大曲中没有差异性;丙酮酸发酵产生乙醇的酶有2种,为乙醇脱氢酶(EC1.1.1.1)和醛脱氢酶(EC1.2.1.5),其在ZW组中丰度显著高于ZGW组(P<0.05);丙酮酸酵解生成乳酸的过程有4种酶,其中丰度较高的是乳酸脱氢酶(EC1.1.1.27和EC1.1.1.28),这2种酶在16S rRNA预测结果显著高于ITS(P<0.05);乙酸代谢主要有2种酶,这些酶细菌预测的丰度高于真菌,在ZGW组中丰度显著高于ZW组(P<0.05);同时逆β-氧化反应生成其他酸的酶在ZGW组中丰度显著高于ZW组(P<0.05),但是这些酶的丰度都较低,说明大曲产中链脂肪酸的能力可能较弱。从氮代谢角度可以看出,形成碳骨架-乙偶姻的生成路径的2种酶(EC1.1.1.76和EC4.1.1.5)的丰度在ZGW组中显著高于ZW组(P<0.05);4种转氨酶的丰度在ZW组中高于ZGW组,但是差异性不显著,同时6种氨基酸脱氨基相关的酶在ZGW组中显著高于ZW组(P<0.05)。整体来讲,碳代谢中的糖化、葡萄糖的利用和产乙醇的相关酶在ZW组中丰度高于ZGW组,这说明ZW组利用淀粉产乙醇的能力高于ZGW组,而产酸的酶和氮代谢相关的酶在ZGW组中丰度高于ZW组,这说明ZGW组的产酸和产氮类化合物的能力高于ZW组。

ATP为三磷酸腺苷;ADP为二磷酸腺苷;Pi为磷酸;NAD(P)H为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸; NAD(P)⁺为烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸。

图6 大曲微生物对浓香型白酒风味形成路径的影响

Fig.6 Effect of Daqu microorganism on flavor formation path of strong flavor Baijiu

*表示酶的丰度呈显著性差异(P<0.05),**表示酶的丰度呈极显著性差异(P<0.01)。

图7 2种大曲微生物代谢产生的酶及其对浓香型白酒风味的影响

Fig.7 Enzymes produced by 2 types of Daqu microorganisms metabolic process and their effects on flavor of strong flavor Baijiu

本研究对2种浓香型白酒生产用曲的理化指标、酶活力指标和微生物群落结构进行了对比分析,发现了中高温大曲和中温大曲在理化指标、酶活力指标和微生物群落结构等方面均存在差异,这种差异势必会导致其发酵性能有所差异。研究所采集的2种大曲样品均来自同一制曲厂,其选用的制曲原料均只有优质小麦,制曲工艺和生产环境基本一样,差异仅仅在中温大曲发酵过程的平均顶火温度在55.6 ℃左右,中高温大曲发酵过程的平均顶火温度在60.4 ℃左右。在制曲过程中温度对大曲的微生物群落结构形成起到重要的推动作用,特别是顶火温度是重要的微生物筛选指标^[10]。2种大曲的顶火温度有所差异,对2种大曲的微生物群落结构形成有重要影响,这可能是导致2种大曲微生物群落差异的重要原因。大曲发酵过程中更高顶火温度筛选获得更多的耐热微生物,在ZGW组中耐热微生物的丰度高于ZW组,比如在ZGW组中嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)和解淀粉芽孢杆菌(B. amylolignefaciens)的丰度分别达到24.6%和7%,而在ZW组中仅为3.4%和3.7%。酵母和乳酸菌的耐热能力较差^[11-12],由于ZW组中的微生物经历的温度筛选压力低于ZGW组,所以在ZW组中这些不耐热的微生物丰度高于ZGW组,这也从反向说明顶火温度筛选的结果。所以仅顶火温度的改变就可以带来大曲微生物群落结构的改变,这也说明大曲制备过程中工艺参数的控制是大曲质量的保证。

理化指标是大曲生产工艺控制和评价指标,2种大曲样品的水分都控制在10%左右,这符合曲的贮存要求。制曲的小麦的淀粉含量一般为50%～65%^[13],2种大曲的淀粉含量保持在53%以上,这保证了得曲率,同时保证了大曲中的还原糖质量分数(ZGW为1.66%,ZW为1.59%),满足微生物的生长需求。ZGW的酸度(0.85%)显著高于ZW(0.76%),这可能是由于ZGW的顶温更高,曲块中富集更多的产酸细菌所导致,但是其含量与已有研究的2种大曲数据相符^[6,14]。从2种大曲微生物群落结构上来看,真菌主要是由多种酵母、嗜热子囊菌、曲霉、根霉等几类组成,细菌主要是由乳酸菌、肠杆菌、芽孢杆菌和高温放线菌等组成,这种优势菌的组成结构与已有的研究报道基本一致^[3,15]。从研究中可以看出2种大曲的酵母多样性较高,优势菌种中共有8种酵母。同时2种大曲各类酵母的丰度存在一定差异,例如ZW中的C. tropicalis和K. ohmeri的相对丰度超过10%,而ZGW中W. anomalus(8.04%)是丰度最高的酵母菌,其占比在ZGW中显著高于ZW。这些酵母的差异可能是导致2种大曲发酵能力存在差异的原因之一。已有研究表明浓香型大曲有较高的高温放线菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属和魏斯氏菌属等^[5,14]。研究也表明这些菌是大曲中的优势菌种,除此之外不动杆菌也是2种大曲中重要优势菌,这可能是由于样品差异性引起的,因为已有研究认为不同地区的浓香型大曲的真菌群落较为相似,而细菌群落差异较大^[5],后期有必要采集不同地区浓香型白酒企业的大曲样品开展验证实验。

酶活力是大曲质量重要的评价指标,大曲中的微生物与酶活力有重要关系。糖化力和液化力是两个反映大曲糖化能力的重要指标,液化力是从淀粉消耗速度的角度反映大曲的糖化能力,糖化力是从还原糖生成的角度反映大曲的糖化能力^[3]。ZW的糖化力和液化力都显著高于ZGW(P<0.05),从微生物碳代谢能力预测中可以看出ZW的α-淀粉酶(EC3.2.1.1)和葡糖苷酶(EC3.2.1.3)显著高于ZGW(P<0.05),这说明微生物群落差异是导致大曲糖化能力差异的重要原因之一。同时淀粉通过糖化转变为还原糖,为微生物生长代谢提供了主要的营养物质,这是白酒发酵过程碳代谢的开始,在一定程度上也决定了碳代谢后期的进度。大曲的发酵力反映产乙醇的能力,大曲中的酵母数量是产乙醇能力的主要评价指标^[12,16]。ZW中酵母科(Saccharomycetaceae)的相对丰度显著高于ZGW(P<0.05),这可能就是ZW的发酵力极显著高于ZGW(P<0.01)的重要原因。在ZGW中的产酯功能菌较多,如W. anomalus和A. amstelodami,W. anomalus已经证明其在发酵过程中产生较多的乙酸乙酯,而曲霉本身就有较强的产酯酶的能力^[17],这可能导致ZGW的酯化能力强于ZG。对于蛋白酶含量,在ZGW中显著高于ZW(P<0.05),其中以酸性蛋白酶为主,这是大曲呈现酸性,并且ZGW的酸度显著高于ZW的环境条件所决定。芽孢杆菌、高温放线菌和嗜热子囊菌有较高的产蛋白酶能力^[18],这些菌在ZGW的相对丰度高于ZW,这可能是ZGW蛋白酶活力较高的原因。同时蛋白酶是蛋白质分解代谢的第一步,也是最关键的一步,2种大曲的蛋白酶活力的差异也可能直接导致2种大曲氮代谢能力的差异。同时已有研究表明氮代谢能力的差异是导致ZGW中的吡嗪类物质风味成分高于ZW的重要原因,这种差异也可能导致酒中该类风味物质存在差异,这将在后续2种大曲对浓香型白酒的酿造影响中进一步深入研究。不同的微生物群落结构对于大曲的酶活力指标都有较大影响,这也是对2种大曲碳氮代谢能力差异的反映,这也直接影响了大曲的酿造特性。2种大曲酿造特性的差异导致生产的浓香型白酒有所差异,目前越来越多浓香型白酒企业选择使用中高温大曲作为生产用曲,其原因可能有以下2点:1)由于现在浓香型白酒酒醅窖内发酵周期较长,对于中高温大曲的糖化和发酵效率要求降低了。2)对于白酒香味物质要求提高了,特别是酸类和氮类化合物的含量都要有所提高,而中高温大曲产酸和氮代谢能力高于中温大曲。这也符合现代浓香型白酒生产的追求,在保证一定的产量情况下,更加注重风味,提高基酒质量。

本研究对浓香型白酒2种常见的生产用曲——中高温大曲和中温大曲的理化指标、酶活力指标、微生物群落结构及代谢功能进行了对比分析。2种大曲的理化指标存在差异性,其中2个理化指标和4个酶活力指标存在显著性差异(P<0.05),包括酸度、顶火温度、蛋白酶活力、糖化力、液化力和发酵力。2种大曲的微生物群落结构也存在差异,用LEfSe方法分析找到了包括橙色嗜热子囊菌、异常威克汉姆酵母和奥默柯达酵母等14个真菌差异性菌种和包括约翰逊不动杆菌、清酒乳杆菌和解淀粉芽孢杆菌等9个细菌差异性菌种。同时通过微生物功能预测发现中温大曲中糖化和发酵相关酶的丰度高于中高温大曲,即中温大曲潜在的产乙醇能力强于中高温大曲;中高温大曲产酸和氮代谢相关酶的丰度高于中温曲,即中高温大曲潜在的产酸和含氮风味物质的能力强于中温大曲。研究有利于进一步认识2种浓香型白酒生产用曲,以期为浓香型白酒的生产提供理论依据和技术指导。后期将对更多类似酒厂的大曲进行解析,以期获得更加全面和深入的研究结果。