渤海大学范金波副教授等：副干酪乳杆菌ET-22及其后生元组分对白念珠菌的抑制作用

白念珠菌是引发口腔念珠菌病的主要致病菌,其作为一种条件致病菌存在于75%健康人口腔中,当宿主防御机制和真菌定植平衡失调导致唾液中白念珠菌含量超过400 CFU/mL时就会引起口腔念珠菌病^[1-2]。目前治疗口腔念珠菌病的主要治疗手段为使用抗真菌药物,主要包括咪唑类、多烯类和棘白菌素等,这些药物的广泛使用可能会导致真菌耐药性恶化,药物疗效显著性降低,从而产生严重的副作用和高昂的治疗成本^[3]。

随着社会的发展,益生菌作为功能食品中的一项重要功能因子,备受消费者关注^[4]。益生菌是指通过摄入足够的数量,能对宿主发挥有益作用的一种微生物制剂,因具有抑制病原菌生长繁殖,优化肠道菌群结构;提高机体免疫力^[5];清除机体自由基;改善机体的血脂情况,降低胆固醇含量^[6]等多种生理功能,故含益生菌的食品在市场上广受关注。目前研究表明,益生菌主要是通过抑制致病微生物和调节口腔菌群对口腔疾病如龋齿、牙周炎起到预防和治疗的作用^[7-8]。研究发现,口服含罗伊氏乳杆菌DSM17938(Lactobacillus reuteri DSM17938)和罗伊氏乳杆菌ATCC PTA 5289(Lactobacillus reuteri ATCC PTA 5289)的益生菌菌片12周后,老年人唾液中白念珠菌浓度和口腔念珠菌病的患病率降低^[9]。近期研究发现,被称为后生元组分的热灭活菌及活菌代谢物对白念珠菌的繁殖及生物膜生成同样具有显著抑制效果^[10-11]。与活菌相比,后生元组分在食品中发挥的功效可能更稳定和优越。目前研究表明,活菌在动物体内对白念珠菌的侵染具有预防功效,但其后生元组分(热灭活菌和分泌物)是否具有类似的功效尚不明确。

本研究以具有预防龋齿和牙周炎功效的副干酪乳杆菌ET-22为实验菌株^[12],拟通过检测抑制白念珠菌体外出芽及菌丝转化的能力以及在动物模型中调节免疫系统和舌苔菌群变化的能力,探究副干酪乳杆菌ET-22活菌及其后生元组分对白念珠菌的抑制作用,旨在为研发具有口腔保健功能的后生元功能食品提供理论参考。

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与实验动物

副干酪乳杆菌ET-22,内蒙古伊利实业集团股份有限公司;白念珠菌CGMCC 2.4122(Candida albicans CGMCC 2.4122),中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。6周龄SPF级ICR雌性小鼠,50只,北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证号为SCXK(京)2019-0008,饲养条件为每天光照12 h,温度为(20±2) ℃,湿度45%～60%,本实验已通过谱尼测试科技有限公司动物实验伦理审查同意,批准号为PONY-2021-FL-43。

1.1.2 实验试剂

MRS固体培养基、MRS培养基,北京陆桥技术股份有限公司;酵母浸出粉胨葡萄糖肉汤培养基,北京奥博星生物技术有限责任公司;MP Fast DNA^TM SPIN Kit for soil DNA提取试剂盒,美国MP Biomedicals公司;Beadstar-mPlex小鼠多细胞因子检测试剂盒,碧芯生物科技(海南省)有限公司;BCA蛋白定量试剂盒,美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器设备

MS 3 basic型涡旋振荡器,德国IKA公司;DPH-9272型恒温培养箱,上海瑞稳仪器设备厂;DM6B型荧光显微镜,徕卡显微系统(上海)贸易有限公司;Legend Micro 17R型冷冻高速离心机,德国赛默飞世尔科技公司;UV-2800A型紫外可见分光光度计,上海元析仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株活化及样品制备

1)白念珠菌菌悬液制备。用生理盐水制备10⁹ cell/mL的白念珠菌菌悬液,用于建造小鼠口腔念珠菌病模型^[13]。

2)副干酪乳杆菌ET-22活菌制备。将10 mL过夜培养的菌悬液离心,用PBS缓冲液洗涤3次,并悬浮在1 mL的PBS中。用2倍稀释法稀释重悬液,用分光光度计测定不同稀释倍数的OD₆₀₀,同时用活菌计数法测定活菌数。确定10¹⁰ CFU/mL对应的OD₆₀₀,并每次以OD₆₀₀为标准,调整重悬液的浓度,现用现制。ET-22活菌干预浓度参考文献中唾液链球菌K12的干预浓度(10⁹ CFU/mL)^[14]。

3)副干酪乳杆菌ET-22热灭活菌制备。通过在70 ℃水浴中放置1 h,对浓度调整后的10⁹ CFU/mL活菌进行热灭活,4 ℃储存备用。

4)副干酪乳杆菌ET-22分泌物制备^[15]。将10⁹ CFU/mL活菌用PBS缓冲液洗涤并加入无菌水中[m(菌泥)∶V(水)=1∶3],室温800 r/min下搅拌2 h,然后离心(4 500 r/min,10 min)取上清液,并用0.22 μm无菌滤膜过滤,4 ℃储存备用。

1.3.2 白念珠菌芽胚管及菌丝转化的测定

将1 mL白念珠菌细胞等分到48孔细胞培养板中(每孔含有2×10⁸ CFU),加入含1 mL ET-22活菌(10⁹ CFU/mL)或后生元组分的RPMI-1640培养基,37 ℃孵育6 h。含有白念珠菌的48孔细胞培养板中加入1 mL RPMI-1640培养基作为对照组。用血细胞计数板计算胚芽管形成率^[16]。将孵育时间延长至16 h,离心后用体积分数为50%的乳酸酚棉蓝染色液染色,并通过荧光显微镜观察菌丝生长状态^[17]。

1.3.3 ET-22活菌及后生元组分抗氧化能力测定

10⁹ CFU/mL的ET-22活菌及后生元组分的DPPH自由基和羟自由基清除率测定参考文献[18-19]。

1.3.4 小鼠口腔念珠菌病模型的建立

1.3.4.1 动物模型构建方法

参考文献[20]并稍加修改,建立口腔念珠菌病模型。将小鼠分为空白组(正常饮食)、模型组(正常饮食+白念珠菌)、实验组[活菌组(正常饮食+白念珠菌+副干酪乳杆菌ET-22活菌)、热灭活菌组(正常饮食+白念珠菌+副干酪乳杆菌ET-22热灭活菌)、分泌物组(正常饮食+白念珠菌+副干酪乳杆菌ET-22分泌物)]。每组小鼠分为2笼,每笼5只。将ET-22活菌及后生元组分分别加入到30 mL的无菌水中,菌浓度为10⁹ CFU/mL,每12 h更换1次。实验组进行18 d的益生菌干预。15 d通过饮用水给小鼠服用15 mg/mL四环素盐酸盐,并进行泼尼松龙(100 mg/kg)皮下注射。16 d对模型组和实验组进行白念珠菌感染,将白念珠菌浸渍的棉签放置在舌背上15 min。小鼠感染白念珠菌48 h后进行安乐死。

1.3.4.2 口腔病症感染程度评估

小鼠被处死后,进行舌病变严重程度的评估观察。根据舌面白色凝乳样斑块的范围和严重程度,进行0至4分的病变评分^[21]。

1.3.4.3 组织学评估

取二分之一的小鼠舌部组织,用体积分数为4%的多聚甲醛固定48h^[22]。委托武汉塞维尔生物科技有限公司进行各组小鼠的舌部组织病理切片处理及HE染色。

1.3.4.4 炎症因子含量测定

1)小鼠血清样本蛋白质水平分析。将血液样本静置30 min后离心(10 000 r/min,15 min),取上清使用小鼠多细胞因子检测试剂盒测定血液上清液中 IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-17的蛋白质水平。

2)小鼠舌部组织样本蛋白质水平分析。取小鼠剩余的舌头,在液氮存在下进行组织匀浆,取上清液用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白含量,对不同小鼠舌部组织总蛋白含量进行均一化。使用小鼠多细胞因子检测试剂盒测定舌组织上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17和趋化因子CCL20的蛋白质水平。

1.3.4.5 口腔微生物菌群结构测定

1)样品采集及总DNA提取。无菌口腔棉拭子刮取小鼠口腔舌苔微生物,剪下无菌棉拭子头于0.5 mL的核酸保护液中,-80 ℃储存。干冰低温寄至上海美吉生物医药科技有限公司,-80 ℃保存备用,直至进行DNA提取。依据细菌DNA试剂盒标准流程从口腔菌群样本中提取DNA。对舌苔菌群样本DNA的完整度、纯度以及浓度进行检验,经检验合格的DNA用于后续实验。

2)菌群Illumina Miseq测序。利用Illumina测序方法及引物(27F 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,1492R 5′-ACCTTGTTACGACTT-3′)对标准细菌的16S rRNA V3～V4区域进行聚合酶链反应扩增。使用PacBio官方推荐的Iso-seq建库方法,使用建库试剂SMRTbellTM Template prep kit 1.0-SPv3完成该样本标准两文库(<4 kb,>4 kb)的构建工作。文库构建完成后,使用测序试剂DNA/Polymerase Binging Kit 3.0进行测序。

3)生物信息学分析。使用QIIME分析平台对初始数据进行整合、拼接、质控后,得到高质量的测序数据。PyNAST校准排齐序列,以100%相似性进行UCLUST归并从而建立无重复的926R→515F序列集。采用两步UCLUST归并,在100%相似性归并的基础上进一步进行97%相似性的归并,从而建立操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)。将OTU代表性序列通过RDP与Greengenes数据库进行(Release13.8)比对及物种注释,比较不同分组在不同分类水平上的组成和丰度分布。利用Beta多样性分析对样品进行主成分分析(PCA),比较样本间的菌群结构差异。

1.4 数据处理

所有数据以平均值±标准偏差表示。每组实验设置3个平行,进行3次重复,使用单向方差分析(ANOVA)和GraphPad Prism 8软件中的Dunnett检验对实验结果进行分析。P<0.05和P<0.01分别表示差异显著和极显著。

2.1 副干酪乳杆菌ET-22活菌及其后生元组分对白念珠菌芽胚管形成及菌丝生长能力的影响

采用血细胞计数方法研究副干酪乳杆菌ET-22活菌及其后生元组分对白念珠菌的芽胚管形成能力的影响,结果如图1。培养6 h后,活菌组、热灭活菌组、分泌物组及对照组的出芽率分别为(13.33±2.03)%、(33.67±4.05)%、(23.17±2.30)%和(51.17±3.41)%。与对照组相比,ET-22活菌组和后生元组的芽胚管形成能力极显著降低(P<0.01)。活菌、热灭活菌及分泌物对白念珠菌芽胚管形成的抑制率分别为38.84%、17.50%和28.00%。同等培养条件下,对照组的芽胚管形成能力低于He等^[23]的研究(80.70%)。这可能是因为不同菌株的白念珠菌的芽胚管形成能力不一样。

**表示数据差异极显著(P<0.01)。

图1 副干酪乳杆菌ET-22活菌及其后生元组分
对白念珠菌芽胚管形成的影响
Fig.1 Effects of L.paracasei ET-22 live bacteria and its postbiotic components on blastoblast tube formation of Candida albicans

采用乳酸酚棉蓝染色方法研究副干酪乳杆菌ET-22及其后生元组分对白念珠菌的菌丝生长能力,结果如图2。ET-22活菌组以浮游单个酵母菌形态和少量出芽状态为主,ET-22死菌组和分泌物组以少量菌丝聚集为主,未形成稳定单层生物膜,而对照组菌丝聚集形成了一层稳定的生物膜结构。白念珠菌的菌丝生长被认为是导致口腔念珠菌病发病的原因之一^[24]。结果表明,副干酪乳杆菌ET-22活菌及其后生元组分对白念珠菌菌丝的转化具有一定的抑制效果。

图2 副干酪乳杆菌ET-22活菌及其后生元组分对
白念珠菌菌丝生长能力的影响
Fig.2 Effects of L.paracasei ET-22 live bacteria and its postbiotic components on growth capacity of Candida albicans

2.2 副干酪乳杆菌ET-22活菌及其后生元组分的抗氧化能力分析

副干酪乳杆菌ET-22及其后生元组分的抗氧化能力见图3。由图3可知,副干酪乳杆菌ET-22活菌及其后生元组分对DPPH和羟自由基均具有清除能力,但清除能力差异较大。ET-22活菌对DPPH清除率极显著高于热灭活菌和分泌物(P<0.01),清除率分别为(92.96±1.00)%、(65.21±8.86)%和(11.86±2.64)%。ET-22活菌和热灭活菌的DPPH自由基清除能力可能与菌体表面的化学物质,如表面蛋白或多糖有关,ET-22分泌物的清除能力可能与菌株分泌的胞外多糖等胞外代谢产物有关^[25]。ET-22热灭活菌体的羟自由基清除率极显著高于ET-22活菌和分泌物(P<0.01),清除率可达(52.59±4.43)%;ET-22活菌与分泌物的清除率无显著差异,分别为(29.31±3.43)%和(29.64±2.90)%。与关于完整活菌细胞对羟自由基的最高清除率为37.61%的研究报道基本一致^[19]。结果表明,副干酪乳杆菌ET-22的菌体表面、胞内成分和胞外分泌物组分中均含有较多清除DPPH和羟自由基的活性物质。

**表示数据差异极显著(P<0.01)。

图3 副干酪乳杆菌ET-22活菌及其后生元组分的抗氧化能力
Fig.3 Antioxidant capacity of L. paracasei ET-22 live bacteria and its postbiotic components

2.3 白念珠菌诱导的小鼠舌部组织损伤分析

各组舌部组织状态见图4。由图4可知,空白组舌部表面光滑、圆润,为淡粉色,呈现正常形态;模型组舌部厚白色斑块状假膜覆盖度大于91%,舌根部厚白色斑块状假膜明显且有轻微脱落现象;ET-22活菌组舌部白色斑块呈现点状,覆盖度小于20%,轻微肿大;ET-22热灭活菌组和分泌物组舌部均出现了不同程度的白色斑块。与空白组相比,模型组、热灭活菌组和分泌物组舌部均出现了明显肿大。各组舌部组织病变损伤评分见图5。由图5可知,模型组和3个实验组(活菌、热灭活菌和分泌物)的损伤评分分别为(3.10±0.88)、(1.67±0.87)、(2.60±1.17)、(2.11±0.93)分。与模型组损伤评分相比,所有益生菌干预组的损伤评分均呈现降低趋势,ET-22热灭活菌组和分泌物组与模型组相比分别降低了16.13%、31.94%;其中ET-22活菌组损伤评分显著降低了46.13%(P<0.05)。结果表明:副干酪乳杆菌ET-22活菌及后生元组分对口腔念珠菌病均具有缓解效果,其中以ET-22活菌的效果最为显著,活菌组舌部状态与空白组最为接近。

图4 白念珠菌诱导的小鼠舌部组织代表性病变分析
Fig.4 Analysis of representative lesions of mouse tongue tissue induced by Candida albicans

*表示数据差异显著(P<0.05)。

图5 白念珠菌诱导的小鼠舌部组织病变损伤评分
Fig.5 Lesion injury scores of mouse tongue tissue induced by Candida albicans

2.4 白念珠菌诱导的小鼠舌部组织状态分析

采用组织学分析小鼠的舌部组织状态,结果如图6。空白组小鼠呈现正常的舌组织,而模型组小鼠表现出乳头缺失、上皮脱屑、棘层松懈、组织增生及上皮内微脓肿等多种上皮病变及强烈的炎症浸润。ET-22活菌干预后,舌部组织棘层松懈和炎症浸润均减轻,上皮组织的保留程度与空白组接近;ET-22热灭活菌组除乳头缺失和上皮脱屑病变有轻微缓解外,其余病变及炎症浸润与模型组基本一致;ET-22分泌物干预后,舌部组织上皮脱屑病变消失,炎症浸润减轻。结果表明,副干酪乳杆菌ET-22活菌及其后生元组分可不同程度地缓解口腔念珠菌病的病变。此结果与副干酪乳杆菌28.4活菌缓解小鼠的口腔念珠菌病的结果一致^[22]。

黑色圆圈为舌背部上皮细胞乳头状突起,红色圆圈为组织增生,黑色箭头为炎症细胞浸润部位,红色箭头为上皮脱落、损伤部位。

图6 白念珠菌诱导的小鼠舌部病变组织学评估
Fig.6 Histological evaluation of mouse tongue lesions induced by Candida albicans

2.5 白念珠菌诱导的小鼠舌部组织细胞因子及趋化因子含量变化

采用小鼠多细胞因子检测试剂盒对小鼠舌部组织中细胞因子及趋化因子的含量进行测定,结果见图7。与模型组相比,ET-22活菌及其后生元组分干预后,促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α含量均出现下降趋势,其中ET-22分泌物干预后IFN-γ和TNF-α含量极显著降低(P<0.01);ET-22活菌干预后TNF-α含量显著降低(P<0.05);其余组则无显著差异。研究发现,鼠李糖乳杆菌在提前饲喂21 d后,用白念珠菌进行侵染,同样降低了组织中IFN-γ和IFN-γ细胞因子的含量^[26]。与模型组和空白组相比,益生菌组的细胞因子IL-10和IL-6含量均无显著差异。白念珠菌细胞膜部分蛋白质有效诱导CD4⁺T细胞分化为产生IL-17A的Th17细胞,继而诱导EGFR和EphA2磷酸化,从而诱导上皮细胞分泌趋化因子CCL20刺激巨噬细胞迁移至病变部位^[27-28]。与模型组相比,ET-22分泌物组趋化因子CCL20的含量无显著差异,可能是由于上游的IL-17A含量偏低导致。ET-22活菌组和热灭活菌组的IL-17A的含量均高于模型组,从而引起趋化因子CCL20的含量极显著高于模型组(P<0.01)。结果表明,ET-22活菌和热灭活菌可能在病变部位,通过激活Th17细胞分泌IL-17A,诱导上皮细胞分泌趋化因子CCL20,CCL20募集巨噬细胞吞噬白念珠菌,从而起到缓解口腔念珠菌病的作用。

*、#分别表示与空白组、模型组之间差异显著(P<0.05),**、##分别表示与空白组、模型组之间差异极显著(P<0.01)。

图7 小鼠舌部组织中白念珠菌诱导的细胞因子及趋化因子变化
Fig.7 Changes in cytokine and chemokine induced by Candida albicans in mouse tongue tissue

2.6 白念珠菌诱导的小鼠血清细胞因子含量变化

采用小鼠多细胞因子检测试剂盒对小鼠血清中细胞因子的含量进行测定,结果见图8。与模型组相比,益生菌干预后IFN-γ、IL-10和IL-17A含量均呈现下降趋势,其中IFN-γ含量均极显著降低(P<0.01),IL-10、IL-17A含量无显著差异。与空白组相比,ET-22分泌物干预后IL-10含量显著降低(P<0.05)。所有组别之间IL-4含量均无显著差异。结果表明,副干酪乳杆菌ET-22活菌及其后生元组分对血清中IFN-γ细胞因子具有调节作用。

*、#分别表示与空白组、模型组之间差异显著(P<0.05),**、##分别表示与空白组、模型组之间差异极显著(P<0.01)。

图8 小鼠血清中白念珠菌诱导的细胞因子变化
Fig.8 Changes in cytokine content induced by Candida albicans in mouse serum

2.7 小鼠舌苔表面菌株变化分析

采用16S rDNA对小鼠舌苔表面菌株进行分析,结果见图9。比色卡的颜色梯度展示的是样本中不同物种的丰度变化情况,可以得出模型组中肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、肠杆菌属(Enterobacter)和变形杆菌属(Proteus)丰度显著高于空白组。ET-22热灭活菌组中,与模型组相比,肠杆菌属和肠杆菌科水平显著上升;在ET-22活菌组显著降低。研究发现,肠杆菌科的丰度上升与口腔念珠菌病的发生具有相关性,如肠杆菌科丰度的上升与复发性阿弗他口炎患者溃疡的发生呈正相关^[29]。

图9 小鼠舌苔科水平和属水平菌群组成
Fig.9 Microbiota composition at family and genus level of mouse coated tongue

与空白组相比,模型组、ET-22活菌和分泌物组的拟杆菌科(Bacteroidaceae)和拟杆菌属(Bacteroides)相对丰度显著增加。研究发现,复发性阿弗他口炎患者黏膜菌群中拟杆菌属的丰度显著高于健康人群^[30]。结果表明,副干酪乳杆菌ET-22活菌组对口腔念珠菌病引起的菌落变化具有调节能力。

基于bray-curtis在科、属水平进行PCA分析,结果如图10。空白组和ET-22活菌组的科水平在PC1(36.91%)轴上[图10(a)],属水平在PC2(31.43%)轴上[图10(b)],与模型组存在显著分离。ET-22分泌物组在科、属水平组成与模型组完全重叠。结果表明,口腔念珠菌病与健康小鼠的舌苔菌群结构组成存在显著差异;ET-22活菌可通过改善模型组舌苔菌群结构对口腔念珠菌病有预防作用。

图10 小鼠舌苔微生物科水平和属水平主成分分析
Fig.10 PCA of mouse coated tongue microorganism at family and genus level

种水平的组间差异性分析结果见图11。与空白组相比,模型组中奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、气球菌(Aerococcus urinaeequi)、盲肠类杆菌(Bacteroides caecimuris)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的相对丰度极显著增加(P<0.01)。与模型组相比, ET-22热灭活菌组显著增加了乳酸乳球菌(Lactococcus)的相对丰度(P<0.05);ET-22活菌组显著增加了副干酪乳杆菌的相对丰度(P<0.05),表明副干酪乳杆菌ET-22定植黏附在小鼠舌苔表面; ET-22活菌的加入明显减少了克雷伯菌属(Klebsiella)的相对丰度,而ET-22热灭活菌则显著增加了克雷伯菌属的相对丰度。乳酸乳球菌可以通过分泌天然抗菌剂乳酸链球菌素抑制白念珠菌菌丝转化和生物膜的形成^[31];变形杆菌、气球菌、粪肠球菌的检出率及丰度在龋齿、牙周炎及其他口腔疾病中均显著高于健康人群^[32-33]。研究发现,克雷伯菌属在牙周炎患者龈下菌群中丰度显著上升,同时肠球菌属和念珠菌属丰度高于健康人群^[34]。结果表明:ET-22活菌可通过在小鼠舌苔表面定植降低致病菌的丰度,ET-22热灭活菌可通过增加有益菌丰度对小鼠舌苔菌群进行调节。

图11 小鼠舌苔微生物种水平差异分析
Fig.11 Difference analysis of mouse coated tongue microbiota at species levels

在体外共培养体系中,10⁹ CFU/mL的ET-22活菌及其后生元组分均能降低白念珠菌的出芽率和菌丝转化能力,从而降低了白念珠菌的侵染能力,其中以ET-22活菌的抑制效果最佳。体外抗氧化结果中,ET-22活菌的DPPH自由基清除能力最强,热灭活菌的羟自由基清除能力最强。

动物模型研究结果表明,副干酪乳杆菌ET- 22活菌、热灭活菌及其分泌物均可以通过抑制白念珠菌,预防口腔念珠菌病的发生,尤其是ET- 22活菌的效果最好。ET-22活菌显著降低了白念珠菌诱导的小鼠舌部组织中促炎因子IFN-γ和TNF-α的含量,并提高了趋化因子CCL20含量,同时调节小鼠舌苔菌群多样性和丰富度,起到减轻舌部组织炎性浸润和黏膜组织损伤的作用。ET- 22热灭活菌和分泌物在抑制白念珠菌、预防口腔念珠菌病方面也具有一定的积极作用。ET-22热灭活菌主要是通过提高趋化因子CCL20含量及调节小鼠舌苔菌群变化,而ET-22分泌物主要是通过降低了小鼠舌部组织及血液中促炎因子IFN-γ和TNF-α的含量起到一定的预防效果。目前应用于口腔健康的功能性食品还处于发展期,副干酪乳杆菌ET-22作为一株优良的口腔益生菌,其活菌和后生元成分的功能研究可为将来开发特异性功能食品配料或开发预防口腔疾病的功能性食品奠定一定的理论基础。

制作：路旭东

编辑：张逸群、李宁

审核：叶红波