天津科技大学王昌禄教授等：基于代谢组学的白黄链霉菌TD-1高产帕马霉素代谢机制

黄曲霉(Aspergillus flavus)是粮谷类食品的主要污染源,常见于谷物、坚果、香料中,其产生的黄曲霉毒素(aflatoxins,AFs)被国际癌症研究机构认定为I级致癌物,已鉴定的AFs有20多种,毒性最大的是AFB₁^[1-3]。防治黄曲霉污染通常是对其产生的孢子和菌丝体的发育进行抑制,主要预防方法包括物理和化学方法,如使用臭氧熏蒸、辐照、高压蒸煮、控制环境因素和使用化学杀菌剂等^[4]。然而,物理方法效率低下、耗费高,还可能会破坏食物的营养与风味。使用化学杀菌剂仍然是目前黄曲霉防治的主要手段,而化学杀菌剂可能会造成化学物的残留,从而导致对人和动物造成伤害。天然杀菌剂具有能够快速排毒、环保、无化学残留和保持食物营养风味等优点,根皮素^[5]、咖啡醇^[6]、柠檬酸^[7]、叶绿素^[8]等天然杀菌剂常被用于防治黄曲霉污染^[9],是解决黄曲霉污染问题的一种有效方法。因此,开发更多安全、有效,能够抑制黄曲霉生长和黄曲霉毒素生物合成的抗真菌天然杀菌剂,对于保障食品安全和公共健康具有重要意义。

帕马霉素是由白黑链霉菌(Streptomyces alboni-ger)、橙黄链霉菌(Streptomyces aurantiacus)、白黄链霉菌等微生物代谢产物中分离出的聚酮类十六元大环内酯型抗生素,可以促进链霉菌中气生菌丝的形成,具有抗革兰氏阳性细菌和植物病原真菌活性的能力,可以从源头上防治粮食污染^[10]。刘彤等^[11]在白黄链霉菌TD-1中分离出帕马霉素,对黄曲霉 2219产生AFB₁的抑制率达到98.3%。

由于帕马霉素化学合成法生产工艺复杂,目前,帕马霉素的生产主要以发酵法为主。优化培养基^[12]、分批补料发酵^[13]、去除代谢副产物^[14]和前体工程^[15]等均可在一定程度上提高帕马霉素的产量;但优化培养基提升效果较差,分批补料发酵副产物较多,去除代谢副产物成本较高。前体工程可以通过添加前体,调整微生物主要代谢通路,阻断竞争通路来增加前体的供应。非蛋白质氨基酸^[16]、苯基丙酮酸^[17]、酪氨酸^[18]和羟基苯基丙酮酸^[19]等前体物可通过初级代谢重新定向到目的产物的代谢流。1,2-丙二醇能够在纳他霉素的合成中诱导乙酰辅酶A和丙酰辅酶A的合成,从而增加次级代谢产物的产量^[20],但未见其在帕马霉素的研究中进行应用。

代谢组学通过量化全部细胞内代谢产物,提供更快速、直接的生理生化状态检测,可全面地测定和评估生命系统对内外干扰的动态多参数代谢反应,是一种强有力的研究工具。Zhang等^[21]利用代谢组学分析方法,分析突变型与野生型结节状链球菌的胞内代谢产物变化,揭示影响两性霉素B生物合成的可能因素。Zhang等^[22]结合代谢组学和网络分析,研究了4种细胞内代谢差异物质对雷帕霉素积累的影响,选择加强(4R,5R)-4,5-二羟基环己酮-1-烯羧酸和还原性辅酶Ⅱ供应,使雷帕霉素产量提高了62.2倍。在代谢组学的基础上,建立可视化和系统的代谢网络模型,研究并富集与目标通路密切相关的初级和次级通路,可以最大限度地提高目标产物产量^[23]。

本研究拟基于代谢组学分析方法,比较是否添加1,2-丙二醇的不同培养状态下白黄链霉菌TD-1生长及代谢与胞内代谢产物的差异。结合显著差异代谢产物与代谢通路的交互关系,希望能够快速、准确地定位影响帕马霉素产量的潜在代谢通路,揭示帕马霉素高产机理,并通过前体物添加策略进行验证。本研究旨在以白黄链霉菌TD-1代谢产生帕马霉素为研究目标,为提高链霉菌次级代谢产物产量提供一种新的思路;同时提供一种潜在的安全、有效、易得的天然杀菌剂,为从源头防治食品中的黄曲霉及黄曲霉毒素污染,保障食品安全提供技术参考。

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌种

白黄链霉菌TD-1,从天津市宝坻区饲料厂周围土壤中分离筛选得到。专利菌株保藏编号CGMCC No.4666。

黄曲霉2219,购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC NO.2219),产生黄曲霉毒素菌株。

1.1.2 主要培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基:马铃薯浸粉6.0 g,葡萄糖20.0 g,琼脂30.0 g,自来水1 000 mL。

M1发酵培养基:可溶性淀粉10.0 g,K₂HPO₄ 1.0 g,MgSO₄·7H₂O 1.0 g,NaCl 1.0 g,(NH₄)₂SO₄ 2.0 g,CaCO₃ 2.0 g,FeSO₄·7H₂O 1.0 mg,MnCl₂·4H₂O 1.0 mg,ZnSO₄·7H₂O 1.0 mg,自来水1 000 mL,pH值7.2。

M2和M3发酵培养基:M2发酵培养基是在M1发酵培养基的基础上添加了5 g/L的1,2-丙二醇;M3发酵培养基是在M1发酵培养基基础上添加了 2 g/L的谷氨酸。

以上培养基灭菌条件均为121 ℃,20 min。

1.1.3 主要试剂

乙酸乙酯、甲醇、乙腈,天津康科德科技有限公司;1,2-丙二醇、乙酸铵、吡啶,阿拉丁试剂有限公司;甲氧基胺盐酸盐、N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTF),美国Sigma公司。除乙酸乙酯与1,2-丙二醇为分析纯,其他实验中所用试剂均为色谱纯。

1.2 仪器与设备

1200型高效液相色谱仪、7890 B-7000 C型气相色谱-质谱联用仪,美国安捷伦公司;Allegra X-30型台式高速离心机,美国贝克曼公司;XMTD-1000型电热鼓风干燥箱,天津市天宇实验仪器有限公司;RE 52-86 A型旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;Seven Easy型酸度计,上海梅特勒托利多仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 帕马霉素对黄曲霉抑制效果的测定

参照刘彤等^[9]的方法,将200 μL帕马霉素粗提液均匀涂布在PDA平板上,待提取液晾干后在平板中央放置一个黄曲霉菌饼,以等量的无菌水作为空白对照,28 ℃培养4 d,利用十字交叉法测量黄曲霉菌落直径,计算生长抑制率。

1.3.2 TD-1菌株发酵液综合分析

取5 mL发酵液,10 000 r/min离心10 min,用0.1 mol/L盐酸洗涤菌丝体1次,Milli-Q水洗涤两次,80 ℃烘至恒重,测定菌丝体干重。以葡萄糖为标准品,采用苯酚-硫酸法测定TD-1菌株发酵液中总糖含量^[24]。使用pH仪监测TD-1菌株发酵液pH值^[25]。

1.3.3 TD-1发酵液中帕马霉素的测定

发酵液与乙酸乙酯按1∶2的体积比混合,1 500 r/min磁力搅拌20 min,静置分层,收集上层有机相。用旋转蒸发仪(45 ℃,50 r/min)将有机相旋蒸至干,用甲醇按1∶100体积比与发酵液复溶,过0.22 μm滤膜,利用高效液相色谱进行检测,根据色谱峰面积对帕马霉素产量进行相对定量分析。

色谱条件:5020-8973 Inertsustain AQ-C 18型色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);DAD检测器波长为230 nm,进样梯度为8 mmol/L,乙酸铵与乙腈的体积比为8∶92;进样量20 μL,时间35 min,流速 1 mL/min,柱温45 ℃。

1.3.4 TD-1发酵液GC-MS分析

在24、48、96 h分别对发酵液取样,将6 mL所取发酵液与30 mL甲醇水溶液(体积分数为60%)混合,冰上孵育5 min,-20 ℃条件下8 000 r/min离心10 min,用20 mL NaCl溶液(质量浓度为9 g/L)重悬浮3次,最终沉淀用液氮研磨并装入1.5 mL管中。将1 mL甲醇水溶液(体积分数为50%)在-40 ℃反复冻融3次,每次2 min,-20 ℃条件下以 10 000 r/min 离心15 min。取200 μL提取液,用氮气吹干,加入50 μL甲氧基胺盐酸盐(20 mg/mL吡啶),在40 ℃条件下衍生化80 min,加入80 μL MSTF,在40 ℃保持80 min。取100 μL衍生后的样品过膜等待上机检测。每个样品进行4个生物学重复,以确保实验结果的可靠性和可重复性。

1)色谱条件。HP-5 MS石英毛细柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升温程序为70 ℃保持2 min,以5 ℃/min升至290 ℃,保持5 min;载气(He)流速为1.0 mL/min,进样量为1 μL;分流比为10∶1。

2)质谱条件。电子轰击(EI)离子源,电子能量70 eV,四极杆温度150 ℃,离子源温度250 ℃,质量扫描范围m/z为50～650。

1.4 数据处理

将GC-MS数据基于保留时间0.5 min以内,峰高≥1 000,以EI碎片相似度80%进行对照,对gap区域进行填充(该化合物在某个样中没有,则对其进行自动补充数据)。用NIST 14谱库进行比对,将离子峰对QC进行数据归一化后,导入到SIMCA 14软件进行OPLS-DA分析,同时采用MetaboAnalyst进行KEGG富集分析。采用Graphpad Pism 9.5软件进行数据显著性分析,采用Origin 2021软件进行数据处理及绘图。实验结果均采用平均值±标准差表示。

2.1 添加1,2-丙二醇对白黄链霉菌TD-1生长及帕马霉素生物合成的影响

2.1.1
添加1,2-丙二醇对帕马霉素抑菌能力的影响

为探究培养基中添加1,2-丙二醇对白黄链霉菌TD-1产帕马霉素抑菌能力的影响,分别以空白组和未添加1,2-丙二醇培养基的M1培养基中代谢产生的帕马霉素为对照,均以黄曲霉为指示菌,采用菌饼法研究不同培养基中白黄链霉菌TD-1所产帕马霉素对黄曲霉的抑制效果,结果见图1。由图1可知,白黄链霉菌TD-1在M1和M2培养基中代谢产生的帕马霉素提取物都能抑制黄曲霉生长,M2培养基帕马霉素提取物对黄曲霉的抑制效果较M1有所改善,能够更明显抑制黄曲霉的生长,说明培养基中添加1,2-丙二醇提高了白黄链霉菌TD-1抑制黄曲霉的能力。

图1 白黄链霉菌 TD-1对黄曲霉生长的抑制情况

Fig.1 Inhibition of S.
alboflavus TD-1 on growth of A.
flavus

2.1.2
添加1,2-丙二醇对白黄链霉菌TD-1发酵及帕马霉素产量的影响

为探究培养基中添加1,2-丙二醇对白黄链霉菌TD-1发酵过程中生长及帕马霉素产量的影响,对白黄链霉菌TD-1在M1和M2两种不同培养基条件下生长及代谢情况进行了研究,结果见图2。由图2可知,在0～24 h达到滞后期(Ⅰ期,0～24 h),TD-1菌丝体生物量、总糖质量浓度及帕马霉素产量呈现显著差异(P<0.05),表明TD-1在M1和M2两种培养基中培养时,在滞后期已经开始出现代谢差异,同时,pH 值均表现出明显下降趋势,表明一些有机酸可能已经产生;在24～96 h,TD-1发酵到对数期(Ⅱ期,24～96 h),帕马霉素积累量、总糖质量浓度和菌丝体生物量均表现出极显著差异(P<0.001),在添加1,2-丙二醇的M2培养基中,帕马霉素在96 h时达到最大积累量,为4 292.69 mAU/min,相较于未添加1,2-丙二醇的M1培养基提高了70%;TD-1发酵到96～156 h达到稳定期(Ⅲ期,96～156 h),96 h后,帕马霉素的积累量呈下降趋势,同时pH值升高至8.6,总糖质量浓度分别降至0.43、0.11 g/L,此时发酵培养基中糖分被完全消耗,菌丝体生物量和pH值基本达到稳定,M1和M2培养条件下帕马霉素产量仅为276.8、711.0 mAU/min,表明低糖与碱性环境不适合帕马霉素的生物合成。

ns表示不显著,*表示组间数据差异显著(P<0.05),**表示组间数据差异非常显著(P<0.01),***表示组间数据差异极显著(P<0.001)。

图2 添加1,2-丙二醇对白黄链霉菌TD-1发酵过程中生长及帕马霉素产量的影响

Fig.2 Effect of 1,2-propanediol addition on growth and pamamycin production of S.
alboflavus TD-1 during fermentation

利用M2培养基培养的白黄链霉菌TD-1的发酵优势更加明显,帕马霉素产量最高提升70%,这与2.1.1中帕马霉素提取物抑制黄曲霉能力的提升具有一定的相关性,是白黄链霉菌TD-1发挥强效抑菌作用的可能原因。然而,仅通过对白黄链霉菌TD-1的生长及代谢的观察,无法探究帕马霉素生物合成过程的关键影响因素。因此,可通过研究添加1,2-丙二醇对白黄链霉菌TD-1的胞内代谢产物及代谢通路等的变化,探究提高帕马霉素产量的影响因素。

2.2 帕马霉素生物合成的代谢组学分析

2.2.1 TD-1菌株胞内代谢产物鉴定

量化胞内代谢产物能够实时反映胞内代谢的变化,快速、直接检测链霉菌动态多参数代谢反应,对探究高产帕马霉素机理至关重要。为测定白黄链霉菌TD-1在M1和M2两种不同培养基中的胞内代谢产物,选取白黄链霉菌TD-1生长对数期(Ⅱ期,24～96 h)的24、48、96 h,对胞内代谢产物进行GC-MS测定,结果见表1。由表1可知,GC-MS检测数据经过NIST 14数据库比对,共鉴定出76种已知的胞内代谢产物,包括20种氨基酸、12种糖、19种有机酸、8种脂肪酸、5种醇和12种其他化合物。

表1 GC-MS检测的胞内代谢产物

Tab.1 Intracellular metabolites detected by GC-MS

2.2.2 显著差异胞内代谢产物分析

为揭示胞内代谢产物对白黄链霉菌TD-1帕马霉素生物合成的贡献,对胞内代谢产物进行OPLS-DA分析,结果见图3。由图3可知,共有27种代谢产物具有显著性差异(VIP>1,P<0.05)。这些显著差异代谢产物包括丙酸、蛋氨酸、十八烷酸、赖氨酸、色氨酸、十六烷酸、酪氨酸、丝氨酸、半乳糖、鼠李糖、异亮氨酸、硼酸、乳糖、亮氨酸、苏氨酸、焦谷氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、琥珀酸、磷脂酸、谷氨酸、1,2-丙二醇、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、γ-戊酮酸、脯氨酸。氨基酸和有机酸类代谢物通过调节代谢通路影响帕马霉素的合成,而脂类和糖类代谢物可能通过影响细胞膜结构和能量代谢间接促进帕马霉素的积累。这些代谢产物的显著变化揭示了1,2-丙二醇通过调控关键代谢途径提高了帕马霉素的产量,为进一步优化帕马霉素生产提供了新的见解和潜在的靶点。

图3 基于胞内代谢产物生成的OPLS-DA模型的VIP值

Fig.3 VIP value of OPLS-DA model generated from intracellular metabolites

2.2.3 显著差异胞内代谢产物与代谢通路对帕马霉素产量的影响

为了解白黄链霉菌TD-1在帕马霉素生物合成过程中添加1,2-丙二醇对胞内代谢产物含量的影响,通过将27种显著差异胞内代谢产物带入KEGG通路并进行注释。注释结果显示中心碳代谢(糖酵解通路、三羧酸循环、磷酸戊糖通路)、氨基酸代谢和脂肪酸代谢通路是影响白黄链霉菌TD-1帕马霉素高产的显著性代谢通路(P<0.05),进而分析白黄链霉菌TD-1高产帕马霉素机制。

2.2.3.1 中心碳代谢通路对帕马霉素产量的影响

由表1可知,鼠李糖、半乳糖、果糖、6-磷酸葡萄糖、呋喃核糖、6-磷酸甘露糖、丙酸、甘油酸、苹果酸、乳酸、丙酮酸和琥珀酸参与中心碳代谢;由图3可知,参与中心碳代谢的显著差异代谢产物丙酸、半乳糖、鼠李糖、乳酸和琥珀酸是影响帕马霉素生物合成的显著差异代谢产物。参与中心碳代谢通路的胞内显著差异代谢产物变化结果见图4。由图4可知,在M1和M2两种不同发酵培养条件下,乳酸含量变化趋势存在差异,其中培养基添加1,2-丙二醇的白黄链霉菌TD-1胞内乳酸含量先增长66.8%后减少69.9%,对照组的乳酸含量先减少0.87%,进一步减少34.2%。乳酸是丙酮酸代谢的一个竞争分支,融合于丙酸和乙酰辅酶A。乳酸的积累量减少会导致乙酰辅酶A池的增加,进入三羧酸循环^[26]。琥珀酸的变化趋势与乳酸的变化趋势相似,这种先增后减的现象可以看作是细胞对自身代谢流的调整。培养基中添加1,2-丙二醇的白黄链霉菌TD-1胞内的鼠李糖、半乳糖、6-磷酸葡萄糖的含量明显高于对照组,半乳糖和6-磷酸葡萄糖均呈下降趋势。结果表明,培养基中添加1,2-丙二醇,白黄链霉菌TD-1的中心碳代谢循环明显强于对照组,添加1,2-丙二醇后的发酵培养基更有利于白黄链霉菌TD-1在对数期(Ⅱ期,24～96 h)利用碳源,提高帕马霉素产量,这与2.1.2中白黄链霉菌TD-1在对数期(Ⅱ期,24～96 h)菌丝体生物量在快速增加和培养基中总糖含量在此阶段快速下降相呼应。

图4 中心碳代谢相关的显著差异胞内代谢产物变化

Fig.4 Changes of significantly different intracellular metabolites related to central carbon metabolism

2.2.3.2 氨基酸代谢通路对帕马霉素产量的影响

由图3可知,参与氨基酸代谢的苯丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、谷氨酸、焦谷氨酸、苏氨酸、亮氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、色氨酸、脯氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、蛋氨酸、丙氨酸和缬氨酸是影响帕马霉素生物合成的显著差异代谢产物。参与氨基酸代谢的细胞内显著差异代谢产物变化结果见图5。由图5可知,与对照组相比,培养基添加1,2-丙二醇后,白黄链霉菌 TD-1胞内支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)的供应水平提高,24 h时积累量分别高出1.01倍、1.0倍和1.13倍,48 h时分别高出2.73倍、2.56倍和2.33倍,在96 h时支链氨基酸含量均出现明显下降,推测亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸降解产生丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A和乙基丙二酰辅酶A,这些降解产物为白黄链霉菌TD-1生物合成帕马霉素提供了充足的扩展单元^[27]。因此,支链氨基酸的供应水平可能是引起帕马霉素产量差异的重要原因。芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸)含量在不同发酵条件下均有所下降,96 h时含量迅速下降。与对照组相比,培养基添加1,2-丙二醇后,白黄链霉菌TD-1胞内酪氨酸的含量及平均消耗率均较高,苯丙氨酸的含量较高但平均消耗率较低。尽管芳香族氨基酸不能作为帕马霉素生物合成的前体,但其通路的减弱可能影响帕马霉素的生物合成。蛋氨酸的供应水平微低于对照组,其可以转化为s-腺苷甲硫氨酸,为帕马霉素的生物合成提供甲基^[28],促进帕马霉素的生物合成。本研究表明,通过优化胞内支链氨基酸和芳香族氨基酸的供应,可以显著影响帕马霉素的生物合成效率,对提高帕马霉素的产量具有重要作用。

图5 氨基酸代谢相关的显著差异胞内代谢产物变化

Fig.5 Changes of significantly different intracellular metabolites related to amino acid metabolism

2.2.3.3 脂肪酸代谢通路对帕马霉素产量的影响

由图3可知,十八烷酸、十六烷酸、磷脂酸是影响帕马霉素生物合成的显著差异代谢产物。参与脂肪酸代谢的胞内显著差异代谢产物变化结果见图6。由图6可知,与对照组相比,培养基添加1,2-丙二醇后,白黄链霉菌TD-1胞内主要脂肪酸和磷脂酸水平均较高,且对数期(Ⅱ期,24～96 h)均下降。在有氧条件下,脂肪酸的代谢可以分解并释放大量的能量和乙酰辅酶A,羧化形成丙二酰辅酶A^[29],并作为生物合成帕马霉素的前体。磷脂酸是细胞膜的组成部分之一,是合成磷酸甘油酯的前提条件,其相应的磷酸盐可以与一些分子结合形成多种磷脂^[30],能够促进帕马霉素的合成。可以推测,十八烷酸、十六烷酸和磷脂酸通过白黄链霉菌TD-1脂肪酸代谢使得胞内初级代谢产物转化生成帕马霉素的前体物质及其他分子,进而影响了帕马霉素的生物合成。

图6 脂肪酸代谢相关的显著差异胞内代谢产物变化

Fig.6 Changes of significantly different intracellular metabolites related to fatty acid metabolism

2.2.3.4 影响帕马霉素产量的关键代谢通路分析

琥珀酰辅酶A是帕马霉素合成的起始单元,乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A和乙基丙二酰辅酶A是帕马霉素生物合成的扩展单元。为阐明影响帕马霉素生物合成的重要代谢通路,基于KEGG数据库对27种显著差异胞内代谢产物进行富集分析。显著性代谢通路与帕马霉素生物合成之间的关系见图7。由图7可知,27种显著差异代谢产物主要参与中心碳代谢、脂肪酸代谢和氨基酸代谢。中心碳代谢通路中的丙酮酸可合成多种氨基酸;支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)的降解产物——丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A和乙基丙二酰辅酶A直接作为帕马霉素合成的前体物质,芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸)可通过琥珀酰辅酶A合成甲基丙二酰辅酶A;脂肪酸代谢合成乙酰辅酶A,而后进一步生成甲基丙二酰辅酶A促进帕马霉素的生物合成。本研究表明,这些关键代谢通路的调节直接影响了白黄链霉菌TD-1帕马霉素的产量,可为进一步优化帕马霉素生产提供新的见解和潜在的靶点。

图7 帕马霉素生物合成的显著性代谢通路分析

Fig.7 Analysis of significant metabolic pathways in biosynthesis of pamamycin

2.3 添加显著差异前体物对帕马霉素产量的影响

外源添加1,2-丙二醇影响白黄链霉菌TD-1代谢通路,进而提高帕马霉素产量(VIP>1,P<0.05)。为验证帕马霉素生物合成显著性代谢通路的分析结果,采用添加显著差异前体物策略,研究是否可进一步提高帕马霉素产量,实验结果见图8。图8结果表明,通过强化中心碳代谢通路(半乳糖、鼠李糖)、氨基酸代谢通路(甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、琥珀酸)和脂肪酸代谢通路(豆油^[31]、磷脂酸),可进一步提高帕马霉素产量。由图8可知,培养基中添加谷氨酸、缬氨酸和豆油的帕马霉素产量高于培养基中添加1,2-丙二醇的帕马霉素产量,帕马霉素产量分别达到5 530.40、4 942.14、4 783.65 mAU/min,高出添加1,2-丙二醇的帕马霉素产量的19.02%、6.36%和2.95%。添加谷氨酸后帕马霉素产量最高,高出空白对照组102.33%。培养基中添加磷脂酸的帕马霉素产量低于培养基中添加1,2-丙二醇的帕马霉素产量,但高出空白对照组8.16%。添加苯丙氨酸的培养基提取物中未检测到帕马霉素。由此推断,谷氨酸、缬氨酸、磷脂酸为白黄链霉菌TD-1潜在的氨基酸代谢通路有益前体物,豆油为白黄链霉菌TD-1潜在的不饱和脂肪酸的有益前体物。本研究表明,前体物的添加显著提高了帕马霉素的产量,进一步验证了KEGG数据库富集分析所揭示的重要代谢通路在帕马霉素生物合成中的关键作用。这为构建白黄链霉菌TD-1工程菌株提供了新的见解和方法,有助于开发更加高效的帕马霉素生产工艺。

不同小写字母表示组间数据差异显著。

图8 外源添加显著差异前体物对帕马霉素合成的影响

Fig.8 Effect of exogenous addition of significantly different precursors on pamamycin synthesis

为进一步验证培养基中添加1,2-丙二醇(M2组)与谷氨酸(M3组)后白黄链霉菌TD-1代谢产生的帕马霉素在农产品防霉应用中的效果,挑选 30 g大小均匀的玉米粒,经灭菌处理后,在其表面喷洒2 mL帕马霉素粗提液,待挥干后接种1 mL黄曲霉孢子悬浮液(1×10⁶ CFU/mL),在平板上对玉米进行防霉实验,实验结果见图9。由图9可知,在M1、M2和M3组中,玉米粒上接种的黄曲霉均没有生长,表明白黄链霉菌TD-1产帕马霉素均能抑制黄曲霉的增殖并且能抑制黄曲霉毒素的合成。

图9 添加不同前体物的帕马霉素粗提液对玉米的防霉效果

Fig.9 Antifungal effect of crude extract of pamamycin with adding different precursors on corn

白黄链霉菌TD-1代谢产生的帕马霉素可以抑制黄曲霉的生长。为解决帕马霉素产量低的问题,本研究利用代谢组学分析白黄链霉菌TD-1发酵过程产生的胞内代谢产物,研究显著差异代谢产物并富集与帕马霉素生物合成密切相关的代谢通路,以指导提高帕马霉素产量。

添加1,2-丙二醇后白黄链霉菌TD-1代谢得到的帕马霉素产量提高了70%,对黄曲霉的抑制效果明显增强,同时表现出明显的发酵优势。基于GC-MS和NIST 14识别比对出76种胞内代谢物,通过OPLS-DA分析鉴定出27种显著影响帕马霉素合成的胞内代谢产物。结合代谢通路分析,1,2-丙二醇通过加强白黄链霉菌TD-1中心碳代谢通路、氨基酸代谢通路和脂肪酸代谢通路,提高了帕马霉素生物合成能力,揭示了帕马霉素生物合成的高产机理。在代谢组学分析的基础上,验证了帕马霉素生物合成高产机理,同时以期进一步提高帕马霉素产量,采用添加显著差异前体物策略,在培养基中分别补充中心碳代谢通路前体物半乳糖和鼠李糖,氨基酸代谢通路前体物甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和琥珀酸,脂肪酸代谢通路前体物豆油和磷脂酸,最终添加谷氨酸使帕马霉素产量提高至5 530.40 mAU/min,比M1组提高了102.33%。今后的研究将结合蛋白质组学和转录组学等多组学分析,进一步阐述帕马霉素高产的机制。

制作：路旭东

编辑：张逸群、李宁

审核：叶红波