江南大学刘双平教授等：低产杂醇高产酯酵母菌株的选育和共酵对黄酒品质的影响及机制分析

高级醇俗称杂醇油,是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在酒精发酵过程中产生的主要代谢副产物^[1],其中2-苯乙醇、异戊醇、异丁醇是加速黄酒醉酒速率的关键化合物。适量的高级醇能够使酒体醇厚、口感协调;含量过高则会对黄酒品质产生负面影响,饮后引发头痛、醉酒等症状^[2-4],甚至引发肝病及肝硬化^[5]。在黄酒中,酯类物质也发挥着重要作用。常见酯类物质,如乙酸乙酯、乳酸乙酯、γ-壬内酯、异丁酸乙酯等,在赋予酒体浓郁水果香和花香的同时,还能起到舒缓神经、促进代谢、降低饮酒不适的作用^[6-7]。因此,在酿酒领域醇酯比是一个重要参数,尤其对于黄酒等发酵酒至关重要。酒体中杂醇和酯的比例,会影响人体对乙醇的代谢,从而影响饮后舒适度^[3,8]。因此,优化醇酯比是提升黄酒品质的关键路径之一。

酿酒酵母参与黄酒发酵过程中绝大多数风味化合物的形成,其性能优劣直接影响黄酒的生产效率与风味品质。然而当前黄酒工厂可专用且发酵性能优良的酿酒酵母数量较少,导致产品风味同质化严重,且杂醇含量相对较高、酯类含量相对较低。因此选育低产杂醇高产酯的酿酒酵母对于高品质和高饮用舒适度黄酒的开发具有重要意义。诱变育种因操作简便、安全性高、突变率高的特点,已经在多种微生物的改良中得到广泛应用。例如,通过硫酸二乙酯-超声波、紫外线复合诱变选育的方法,获得一株低双乙酰低杂醇的啤酒酵母菌种,其产杂醇含量降低了49.07%^[9]。而采用诱变技术结合长期驯化的手段,可获得发酵啤酒香气更和谐的优良突变株,且啤酒中的杂醇含量减少、酯类增加^[10]。

酿酒酵母是双倍体菌株,若在产生突变性状时只有单个基因发生突变,其在传代过程中可能会导致优良性状的衰退。生孢纯化技术能够使双倍体营养体通过产生子囊孢子生成单倍体,在HO基因(haploid-to-diploid overexpression)未敲除的情况下单倍体自身会转化为纯合双倍体,有效提高突变菌株的遗传稳定性^[11]。

除选育性能优良的酿酒酵母外,酿酒酵母和非酿酒酵母的共酵也能够优化黄酒醇酯比进而提升发酵产品的品质。不同于酿酒酵母,非酿酒酵母(non-Saccharomyces yeasts,NSYs)酒精发酵能力弱,乙醇耐受性低,但其代谢产物及分泌的酶类能促进酿酒酵母利用葡萄糖等发酵底物,产生酯和酸等芳香化合物,对最终的风味产生积极影响。采用异常威克汉姆酵母与酿酒酵母共发酵白酒,乙酸乙酯产量可显著增加^[12]。有研究利用粟酒裂殖酵母与酿酒酵母同时接种发酵“黑比诺”葡萄酒,发现杂醇含量降低,乙酸异戊酯、辛酸甲酯等含量提高,酒样酸甜平衡,花果香浓郁^[13]。目前对于黄酒的相关研究较少,且大多只停留在共酵工艺的开发,缺少深度的机理解析。非酿酒酵母的添加必然会引发一系列代谢物的变化,应用代谢组学分析能够全面系统地对其展开研究,深入探讨非酿酒酵母的加入对于体系中代谢途径和代谢产物的调控机制。

本研究团队前期通过自然选育的方式获得1株优良酿酒酵母jiangnan1#^[14-15],该菌株发酵性能好,经生产验证降低杂醇的能力显著优于工厂现用菌株,但在醇酯比优化方面仍存在进步空间。因此本研究以该菌株为出发菌株,通过紫外诱变、常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变的两轮诱变育种的方式进一步增强酵母菌株对于黄酒醇酯比的优化效果。基于生孢纯化技术提高遗传稳定性后,构建与非酿酒酵母的共酵体系,优化共酵工艺,最后通过代谢组学深度解析共酵的差异形成机制。此项研究旨在解决黄酒醇酯比不平衡的痛点问题,在提供菌种资源的基础上进一步提升黄酒风味及饮用舒适度,以期为黄酒传统发酵工艺中新菌株的引入提供一定的理论参考。

1.1 实验材料

酿酒酵母jiangnan1#(专利号:CN202110891798.3),已应用于黄酒工业化生产;酿酒酵母Ygc(江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心保藏编号:RWBL Y2315 LY),为从黄酒厂采集的厂区在用酿酒酵母。

非酿酒酵母:具备潜在产酯性能的非酿酒酵母52株(菌株均来自江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心,菌株信息见附表1),选择的非酿酒酵母主要为毕赤酵母、扣囊复膜酵母、异常威克汉姆酵母、粟酒裂殖酵母等,部分关键菌株信息见表1。

表1 菌株信息

Tab.1 Information of strains

*查询网址为https://rctff.jiangnan.edu.cn/info/1087/1663.htm。

黄酒生产使用麦曲(块曲和熟麦曲)以及酒汗,取自浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司;糖化酶(货号S10018,酶活100 000 U/mL),源叶生物科技有限公司;液化酶(货号A8750,酶活40 000 U/g)、蜗牛酶(货号S8280),北京索莱宝科技有限公司。

4种杂醇(正丙醇、异丁醇、异戊醇、2-苯乙醇)、15种酯类(乙酸乙酯、异丁酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯、2-苯乙酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、丁二酸二乙酯、γ-壬内酯、丙酸乙酯)、2种内标(4-甲基-2-戊醇、2-辛醇),均为色谱纯标准品,上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

M100型生物传感器分析仪,深圳市希尔曼科技有限公司;CT88A型全自动立式蒸汽灭菌器,驰通仪器(上海)有限公司;超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;恒温恒湿培养箱,上海凯测实验设备有限公司;CR21N型落地式高速冷冻离心机,日本工机控股株式会社;vortex-genie2 G560E型漩涡混合器,美国科学工业公司;FE20型pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;N-12型折光仪,日本ATAGO公司;总酸和氨基酸态氮自动滴定仪,配置雷磁SCH-01型自动样品进样器、ZDJ-5B型自动滴定仪,上海仪电科学仪器股份有限公司;1100型高效液相色谱仪,美国安捷伦公司;Trace 1300 ISO型气相色谱-质谱联用仪,赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基的配制

酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)培养基:酵母提取物10 g/L、鱼粉蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L。YPD平板是液体培养基中加入质量浓度为18 g/L的琼脂。

预产孢培养基:w=1%的KAc、w=1%的酵母提取物、w=2%的蛋白胨,在121℃下灭菌15 min。

高效产孢培养基:w=1%的KAc、w=0.1%的酵母提取物、w=0.05%葡萄糖、腺嘌呤50 mg/L、组氨酸100 mg/L、尿嘧啶50 mg/L、色氨酸100 mg/L、亮氨酸100 mg/L,在121 ℃下灭菌15 min。

大米糖化液培养基:生米浸泡后蒸熟,按生米质量与水的质量比为1∶4混合,加入生米质量分数2‰的液化酶、1‰的糖化酶和10%的生麦曲,将温度控制在60 ℃水浴,糖化液化4 h左右,用折光仪测定糖度,至糖度在13°Brix左右,糖化结束。过滤分装,115 ℃灭菌20 min,冷却后备用。

1.3.2 紫外诱变条件的确定

取5 mL对数生长期出发菌株的菌悬液于无菌培养皿,置于15 W紫外灯下20 cm处,分别照射20、40、60、80、100、120、140、160、180 s。取各照射时间段诱变后的菌悬液稀释,涂布于YPD平板,28 ℃避光培养48 h,记录平板菌落数,计算诱变致死率,见式(1)。

诱变致死率=(对照组菌落数-诱变组菌落数)/对照组菌落数×100%。

(1)

1.3.3 ARTP诱变条件的确定

将紫外诱变后选育的酿酒酵母培养至对数生长期,稀释菌液至适宜浓度备用。等离子体的照射距离2 mm,气流量10 L/min,功率100 W,诱变时间分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 s。诱变后的菌悬液进行梯度稀释,涂布到YPD平板,28 ℃于恒温培养箱中倒置培养48 h,记录平板菌落数,计算诱变致死率,计算方法同式(1)。

1.3.4 双倍体正菌株的生孢纯化方法

1.3.4.1 预产孢处理

在100 mL YPD液体培养基中培养到对数生长期,菌液经10 000 r/min离心30 s,弃上清,用无菌水洗3次,用预产孢培养基重悬,22 ℃、200 r/min培养24 h^[11]。

1.3.4.2 高效产孢处理

将预产孢培养基中菌液10 000 r/min离心30 s,弃上清后,重悬加到100 mL高效产孢培养基,22 ℃、200 r/min培养。每隔24 h取样,用石炭酸复红染色法观察产孢情况,每次取3个视野,计算产孢率。

产孢率计算。梯度稀释后用油镜观察子囊孢子,记录视野内子囊数量和未形成子囊的双倍体营养细胞数,5次平行实验,计算产孢率。产孢率计算见式(2)。

产孢率

(2)

1.3.4.3 单倍体的获得

当产孢率达到90%时,先灭活双倍体的营养体,再分离得到单倍体。

灭活双倍体的营养体:将高效产孢培养基中菌液10 000 r/min离心30 s,弃上清液,用pH=7的磷酸钠缓冲液重悬并洗涤,65 ℃水浴加热10 min,取样涂布于YPD平板培养以验证双倍体营养菌株完全灭活^[11]。

单倍体分离:离心菌液加入1 mL的0.3 g/L蜗牛酶和无菌玻璃珠,28 ℃震荡0.5～1 h,酶解子囊壁使单倍体释放,5 000 r/min离心5 min收集菌体,磷酸钠缓冲液洗涤后溶解该菌体,用12 W超声波处理60 s使菌体的孢子分散,用十倍稀释法将孢子悬液稀释5次,每梯度取100 μL涂布于YPD平板,30 ℃培养1～2 d^[11]。

1.3.4.4 黄酒发酵纯化菌株的筛选

挑取YPD平板上的菌株进行黄酒发酵筛选,发酵结束后测定黄酒基本理化指标、杂醇和酯类的含量,每组3次平行。

1.3.5 菌株传代稳定性的测定

将生孢纯化后得到的双倍体正菌株在YPD平板上传代培养5代,每代进行黄酒发酵,测定基本理化指标、杂醇、酯类的含量。以符合基本理化为基础,低产杂醇、高产酯为评价指标筛选确定遗传稳定性良好的酿酒酵母突变株。

1.3.6 实验室模拟黄酒的发酵条件

1)酒母的制备。将酵母菌株的种子液接种至大米糖化液,接种量为大米糖化液体积分数5%的种子液,28 ℃、200 r/min培养48 h。

2)黄酒发酵条件。关键步骤:浸米、蒸米、晾米、混料,模拟黄酒发酵体系见表2。发酵过程:前酵(主发酵阶段)在28 ℃下发酵5 d,再后酵在15 ℃下发酵15 d^[15]。

表2 模拟黄酒发酵体系配料

Tab.2 Ingredients of simulated Huangjiu fermentation system

1.3.7 黄酒共酵体系的构建及其条件优化方法

在黄酒仅用酿酒酵母单菌发酵工艺的基础上,采用酿酒酵母与非酿酒酵母同时接种的方式,分别考察了非酿酒酵母的种类(52株)、酿酒酵母与非酿酒酵母的酒母添加的体积比例(1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000)、主发酵阶段的温度(20、24、28、32、36 ℃)对黄酒中杂醇和酯类的影响,对共酵条件进行优化。

1.3.8 黄酒基本理化指标的测定

参照GB/T 13662—2018中的方法进行酒精度测定;还原糖的测定采用DNS法(3,5-二硝基水杨酸法);pH值采用pH计测定;总酸和氨基酸态氮含量使用总酸和氨基酸态氮自动滴定仪测定。

1.3.9 黄酒中主要杂醇和酯类化合物的测定

参考文献[16]的方法,使用分散液-液微萃取结合气相色谱-质谱联用仪(dispersive liquid-liquid microextraction-gas chromatography-mass,LLME-GC-MS)测定模拟黄酒发酵结束后正丙醇、异丁醇、异戊醇、2-苯乙醇等4种杂醇类化合物的质量浓度。

参考文献[17]的方法,使用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用仪(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass,HS-SPME-GC-MS)测定黄酒中乙酸乙酯、异丁酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯、2-苯乙酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、丁二酸二乙酯、γ-壬内酯、丙酸乙酯等15种酯类化合物的质量浓度。

1.3.10 黄酒体系中代谢物的分析

委托上海百趣生物医学科技有限公司使用气相色谱飞行时间质谱(gas chromatography-time of flight-mass spectrometry,GC-TOF-MS)和超高效液相色谱与四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(ultra high performance liquid chromatography-quadrupole electrostatic field orbitrap-mass spectrometry,UHPLC-QE-MS)对酿酒酵母单菌发酵、酿酒酵母与非酿酒酵母共酵的黄酒发酵液进行非靶向代谢组学分析,以识别共酵体系和单菌发酵体系的差异表达代谢物(differentially expressed metabolites,DEMs)。GC-TOF-MS对代谢物提取及质谱条件参考文献[18],UHPLC-QE-MS对代谢物提取及质谱条件参考文献[19-20]。

采用火山图分析差异代谢物,差异代谢物的筛选条件为VIP>1且P<0.05。基于单变量分析,依据物质在两组实验间倍数关系的对数值log₂(FC)以及-lg(P)作为显著差异代谢物的判别条件。

1.4 数据处理

利用Origin 2024进行数据分析及绘图;利用IBM SPSS Statistic 26进行相关性分析及多元统计分析。

2.1 紫外诱变及ARTP诱变菌株的筛选结果

酵母是决定黄酒风味物质含量的主要因素,研究表明不同酵母的风味物质生成差异量可达50%～100%,而降低杂醇提升酯类最有效的方法就是选育优良酵母。实验室先前通过自然选育获得一株低产杂醇高产乙酸酯的酿酒酵母,本研究将在其基础上进行诱变选育,进一步加强对黄酒醇酯比的优化效果。

2.1.1 紫外诱变结果

一般认为致死率达到90%左右有利于正突变菌株的产生^[21],经实验优化选择了140 s作为紫外诱变照射时间。对紫外诱变酿酒酵母jiangnan1#得到的135株突变菌株进行黄酒模拟发酵,发酵结束后测定酒精度、杂醇等指标。由于菌株产乙醇能力的差异性,通常生成高含量的乙醇会对应产生高含量的杂醇^[15],为确定菌株的杂醇生成能力,筛选阶段以出发菌株jiangnan1#作为对照,计算单位酒精度的杂醇含量,对黄酒中3种含量较高的杂醇(2-苯乙醇、异丁醇、异戊醇)进行对比分析。以黄酒中3种杂醇单位酒精度质量浓度为判断依据,紫外诱变酿酒酵母的筛选结果见图1。图1(a)为紫外诱变菌株的初筛结果,图1(b)为复筛验证结果,最终得到一株低产杂醇的优良突变菌株,命名为酿酒酵母Y23-1-35。与出发菌株酿酒酵母jiangnan1#相比,酿酒酵母Y23-1-35的杂醇质量浓度降低了11.72%。因此,选择酿酒酵母Y23-1-35进行下一轮的ARTP诱变。

图1 酿酒酵母紫外诱变的筛选结果

Fig.1 Screening result of Saccharomyces
cerevisiae induced by UV mutagenesis

2.1.2 ARTP诱变结果

ARTP诱变时间不仅影响致死率,同时能显著影响突变效率,合适的诱变时间是菌株选育的关键。以黄酒中杂醇(单位酒精度)、酯类质量浓度为判断依据,ARTP诱变酿酒酵母Y23-1-35的筛选结果见图2。随着诱变时间增加,酿酒酵母Y23-1-35的致死率不断增加,诱变处理10 s时,诱变致死率为83.77%,当诱变处理时间为30 s时,致死率达98.34%,综合考虑选择30 s作为ARTP诱变处理时间。

图2 酿酒酵母ARTP诱变的筛选结果

Fig.2 Screening result of Saccharomyces
cerevisiae induced by ARTP mutagenesis

针对ARTP诱变获得的87株突变菌株进行黄酒模拟发酵,图2(a)为ARTP诱变菌株初筛结果,图2(b)为复筛结果,筛选后得到了效果较好的菌株,命名为酿酒酵母YAR28,其单位酒精度的异戊醇质量浓度较对照组(酿酒酵母jiangnan1#)降低了15.97%,2-苯乙醇质量浓度降低了16.72%,总杂醇质量浓度(除正丙醇外)降低了14.00%。

对酿酒酵母YAR28产黄酒的酯类含量进行分析,结果见图3。由图3可知,酯类质量浓度较对照组(酿酒酵母jiangnan1#)升高了30.66%,其中γ-壬内酯、乳酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、异丁酸乙酯质量浓度均升高。

图3 ARTP诱变对酿酒酵母酯类产量的影响

Fig.3 Effect of ARTP mutagenesis on ester production of Saccharomyces
cerevisiae

2.2 低产杂醇高产酯酿酒酵母诱变菌株的生孢纯化及传代稳定性验证结果

生孢纯化能够增强微生物的稳定性,提高实验和生产的可重复率。对突变菌株酿酒酵母YAR28进行生孢纯化处理,通过黄酒模拟发酵筛选YPD平板上的纯化后菌株。最终获得一株产醇酯比较佳的酿酒酵母,命名为酿酒酵母Y28-23。杂醇产量显著低于纯化前的菌株YAR28,且其发酵生成的乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、异丁酸乙酯、乳酸乙酯等质量浓度均高于纯化前菌株。因此,证明生孢纯化取到了良好的效果。

将酿酒酵母Y28-23在YPD平板上连续传代培养5代,每代酵母菌株作为酒母进行黄酒发酵,进行稳定性验证,结果见表3。由表3可知,传代5次后菌株的酒精产量没有显著性差异(P>0.05);杂醇产量[(378.16±28.76)mg/L]低于“不上头”总杂醇质量浓度400 mg/L的限量标准^[15],较出发菌株jiangnan1#降低了21.41%,其中异丁醇产量降低17.07%,异戊醇产量降低24.52%,2-苯乙醇产量降低24.22%;酯类产量为(152.86±19.73)mg/L,较出发菌株jiangnan1#增加了35.57%,其中乙酸酯产量增加44.07%,异丁酸乙酯产量增加119.04%,丁酸乙酯产量增加27.03%,γ-壬内酯产量增加64.90%。经传代实验验证,酿酒酵母Y28-23优化黄酒醇酯比的性能稳定,可为黄酒工厂发酵提供重要菌种资源。

表3 酿酒酵母Y28-23传代稳定性实验结果

Tab.3 Heredity results of Saccharomyces cerevisiae Y28-23 mg/L

不同小写字母表示同行数据差异显著(P<0.05)。

2.3 黄酒共酵体系的构建及其条件优化结果

实验室前期研究发现,非酿酒酵母与酿酒酵母同时接种共同发酵,在保障发酵效率的基础上还能促进积极风味的形成,如花香、果香和坚果香^[22-23],有助于调节酿造酒中生物胺、杂醇等成分的含量,提高最终产品的微生物稳定性。因此本研究进一步筛选非酿酒酵母,将其与酿酒酵母Y28-23共酵,并探寻2种酵母共酵的较优条件,以进一步优化黄酒的醇酯比、提升品质。

2.3.1 非酿酒酵母的选择

黄酒中的风味物质种类很多,主要以醇类和酯类物质为代表,它们共同影响着黄酒的风味质量。为评价不同非酿酒酵母对黄酒品质的影响,以实验室原有的52株具备潜在产酯性能的非酿酒酵母为研究对象,与酿酒酵母Y28-23分别进行共酵,发酵结束后根据酒精度等理化指标筛选出发酵性能良好的混菌组合,再基于杂醇和酯类物质含量进行评价。部分关键菌株与酿酒酵母Y28-23共酵的实验结果见表4。由表4可知,异常威克汉姆酵母Y34与酿酒酵母Y28-23共酵时,发酵样品基本理化指标均满足GB/T 13662—2018的要求,单位酒精度杂醇产量最低[(14.07±0.12)(mg·L^-1·%vol^-1)],15种酯类物质的总OAV[(53.61±0.41)]也最高。根据文献报道,异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)是酒中产乙酸乙酯的主要非酿酒酵母菌株,能产生大量具有水果风味的酯和醇。

表4 酿酒酵母Y28-23与非酿酒酵母混菌共酵的黄酒指标

Tab.4 Indicators of co-fermentation with mixed cultures of Saccharomyces cerevisiae Y28-23 and non-Saccharomyces yeasts

*15种酯类化合物的OAV计算使用的阈值来自参考文献[24];不同小写字母表示同列数据差异显著(P<0.05)。

因此选定异常威克汉姆酵母Y34与酿酒酵母 Y28-23 进行共酵。

2.3.2
酿酒酵母Y28-23与异常威克汉姆酵母Y34较佳接种比例的确定

进一步优化酿酒酵母Y28-23与异常威克汉姆酵母Y34的共酵条件,优化酿酒酵母与非酿酒酵母的酒母添加的体积比例(1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000),发酵结果见表5。由表5可知,当酿酒酵母与非酿酒酵母的酒母添加的体积比例为1∶100、1∶1 000时,酿酒酵母数量较少导致主发酵前期酒精度升高太慢,无法抑制杂菌生长,发酵结束后酒精度低、总酸高,存在发酵停滞或发酵终止的风险,故排除这2个比例。而当酿酒酵母与非酿酒酵母的酒母添加的体积比例为1∶1、1∶10时发酵能够正常进行。

表5 接种比例对酿酒酵母Y28-23与异常威克汉姆酵母Y34混菌共酵的黄酒指标的影响

Tab.5 Effect of inoculation ratio on indicators of Huangjiu co-fermentation with mixed cultures of Saccharomyces cerevisiae Y28-23 and Wickerhamomyces anomalus Y34

不同小写字母表示同列数据差异显著(P<0.05)。

对酿酒酵母Y28-23与异常威克汉姆酵母Y34的共酵生成的15种酯类物质总OAV进行分析,结果见图4。结合表5和图4可知,当接种比例为1∶10时,发酵体系的杂醇含量较低、酯类含量较高、醇酯比较优。因此,酿酒酵母Y28-23与异常威克汉姆酵母Y34的较佳接种比例为1∶10。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图4 接种比例对酿酒酵母Y28-23与异常威克汉姆酵母Y34混菌共酵的黄酒风味的影响

Fig.4 Effect of inoculation ratio on flavor of Huangjiu co-fermentation with mixed cultures of Saccharomyces
cerevisiae Y28-23 and Wickerhamomyces
anomalus Y34

2.3.3 主发酵阶段温度的确定

温度是控制酵母代谢产生风味物质的重要手段之一,研究表明酵母在较高温下代谢合成杂醇的能力显著高于低温条件下,且较高的发酵温度并不利于酵母胞内酯类物质的代谢生成^[25]。主发酵阶段的温度对酿酒酵母Y28-23与异常威克汉姆酵母Y34混菌共酵的黄酒中杂醇含量、酯类化合物OAV的影响结果见图5。由图5可知,当发酵温度为20 ℃时,醇酯比较低;随着发酵温度的升高,醇酯比先升高后降低;而当发酵温度高于32 ℃时,过高的温度抑制了酿酒酵母的正常生长和发酵活性,导致体系酒精度不达标。因此,最终确定共酵较佳发酵温度为20 ℃。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图5 温度对酿酒酵母Y28-23与异常威克汉姆酵母Y34混菌共酵黄酒品质的影响

Fig.5 Effect of temperature on Huangjiu quality of co-fermentation with mixed cultures of Saccharomyces
cerevisiae Y28-23 and Wickerhamomyces
anomalus Y34

2.3.4 较佳共酵条件的验证实验

将酿酒酵母Y28-23与异常威克汉姆酵母Y34进行混菌共酵,接种比例为1∶10,主发酵阶段的温度为20 ℃。该优化条件下的黄酒发酵样品理化指标(见表6)均满足GB/T 13662—2018的要求;杂醇质量浓度为(281.20±5.73)mg/L,相比酿酒酵母Y28-23单菌发酵降低了25.63%,显著提升了黄酒的饮用舒适度;酯类质量浓度为(240.02±2.47)mg/L,相比酿酒酵母Y28-23单菌发酵升高了57.13%。郑超群^[26]基于酿酒酵母和异常汉逊酵母共发酵黄酒,所得挥发酯质量浓度为(166.00±0.028)mg/L;王晓蕊^[27]基于酿酒酵母和库德毕赤酵母共发酵黄酒,所得杂醇质量浓度为350.48 mg/L,乙酸乙酯质量浓度为77.19 mg/L。可以看出,本研究的共酵工艺相比过往研究进一步优化了黄酒的醇酯比。且低温共酵工艺在保证顺利发酵的情况下,也充分发挥了酿酒酵母Y28-23与异常威克汉姆酵母Y34的各自优势,可有效改善黄酒的品质和风味。

表6 优化共酵条件下黄酒的品质指标

Tab.6 Quality index of Huangjiu under optimized co-fermentation conditions mg·L^-1

不同小写字母表示同行数据差异显著(P<0.05)。

2.4 基于代谢组学的共酵对黄酒风味影响机制的分析结果

使用GC-TOF-MS和UHPLC-QE-MS对黄酒发酵液进行非靶向代谢组学分析,以识别共酵体系和单菌发酵体系的差异表达代谢物。根据正交偏最小二乘判别分析(orthogonal projections to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA),2种分析方法共筛选到2 025种差异代谢物,共酵体系相比单菌发酵体系,上调的物质共有1 083种,下调的共有942种(图6)。这些差异代谢物主要包括生物碱及其衍生物60种、氨基酸和肽55种、苯类化合物146种、碳水化合物19种、脂肪酸91种、脂质和类脂分子149种、核苷酸及类似物11种、有机酸及其衍生物248种等。

图6 共酵体系和单菌发酵体系的黄酒差异表达代谢物火山图

Fig.6 Differentially expressed metabolites volcano plot of Huangjiu in co-fermentation system and single-Saccharomyces
cerevisiae fermentation system

基于单变量分析,得到显著上调的代谢物有2-氨基嘧啶、腺嘌呤、谷氨酸二乙酯、3-羟基-2-氨基苯甲酸、D-葡糖-6-磷酸、半胱氨酸、D-阿拉伯糖醇、3,6-脱水-D-半乳糖、天冬氨酸、L-高丝氨酸、阿洛糖、3-羟丙酸等物质;显著下调的代谢物有天冬酰胺、2-羟基-3-异丙基丁二酸、4-甲基-2-氧代戊酸、L-别苏氨酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、丙二酰胺、L-苹果酸、L-苏糖、次黄嘌呤、肌苷等物质。以上物质的调控为黄酒风味物质的形成做出了潜在贡献,其中次黄嘌呤是尿酸的关键前体物质,该物质的下调表明异常威克汉姆酵母与酿酒酵母共酵可以通过减少饮后尿酸等有害物质的生成来提高黄酒的饮用安全性^[28];同时还会降低黄酒中苦味物质的含量,进而实现优化黄酒风味的目的。

为进一步探究共酵过程中异常威克汉姆酵母为风味形成贡献了哪些代谢产物,对所得差异代谢物进行了代谢通路注释(图7)。由图7可知,差异代谢物主要集中在酪氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、次生代谢产物的生物合成、鞘脂代谢、赖氨酸合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、氨基酸生物合成、ABC转运蛋白、β-丙氨酸代谢等过程,上述代谢过程与共酵过程中底物的利用以及黄酒舒适性化合物的形成密切相关^[29],其中鞘脂代谢是与差异代谢物相关性最高的代谢通路,是共酵形成差异的主要途径;共酵体系中真核微生物的增加可能是造成差异代谢物显著富集鞘脂代谢通路的原因,这与李琼^[30]的研究结果相符;鞘脂代谢的上调会对黄酒的品质、营养价值和稳定性产生积极影响,使其在口感、香气、抗氧化能力和色泽等方面更加优越。此外,异常威克汉姆酵母Y34的添加通过上调酪氨酸等代谢通路,促进了芳香化合物合成产量的增加^[29];上调甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢通路,促进了酿酒酵母Y28-23的糖酵解过程^[31]。

*为0.01<P<0.05,**为0.001<P<0.01,***为P<0.001。

图7 共酵体系和单菌发酵体系的黄酒差异表达代谢物的代谢通路注释

Fig.7 Differentially expressed metabolites metabolic pathways annotation of Huangjiu in co-fermentation system and single-Saccharomyces
cerevisiae fermentation system

目前,关于多菌株共酵的代谢研究文献较为匮乏,未能全面探究多数发酵体系中微生物的相互作用。本研究以代谢组学的视角探究此问题,深入解析了2.3节中共酵对于黄酒品质提升的机制,可为后续黄酒工业引入新菌株、改进传统发酵工艺提供理论参考。

为优化黄酒醇酯比,提升黄酒饮用舒适度和风味品质,本研究基于黄酒生产工艺建立菌株筛选策略,以酿酒酵母jiangnan1#作为出发菌株,经紫外诱变和ARTP诱变共获得222株突变株,结合生孢纯化技术最终获得一株低产杂醇高产酯且遗产稳定性良好的突变菌株,即酿酒酵母Y28-23。该酿酒酵母的酒精产量没有显著性差异(P>0.05),但产杂醇的质量浓度[(378.16±28.76)mg/L]比出发菌株降低了21.41%,且产酯的质量浓度[(152.86±19.73)mg/L]增加了35.57%。将酿酒酵母Y28-23与52株具备潜在产酯性能的非酿酒酵母共酵,以低产杂醇高产酯为评价指标,最终确定了异常威克汉姆酵母Y34为较佳的非酿酒酵母。进一步优化酿酒酵母Y28-23与异常威克汉姆酵母Y34的共酵条件,发现在主发酵阶段的温度为20 ℃的条件下以1∶10的添加比例共酵黄酒,对于黄酒醇酯比的优化效果较佳,杂醇的质量浓度为(281.20±5.73)mg/L,酯类的质量浓度为(240.02±2.47)mg/L。相比于单菌发酵,黄酒中杂醇的质量浓度降低了25.63%,而酯类的质量浓度增加了57.13%。最后,研究基于代谢组学分析,发现异常威克汉姆酵母Y34的加入会通过上调发酵体系中的鞘脂、酪氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸等代谢通路,促进酿酒酵母的糖酵解过程以及体系中芳香化合物合成产量的增加,对黄酒品质产生积极影响。

本研究针对黄酒中的酵母菌株进行了有益探索,低产杂醇高产酯酵母菌株的获得可为黄酒工厂提供重要的菌株资源,低温共酵条件的确定有效优化了黄酒的醇酯比,研究可为利用发酵菌株控制黄酒酿造过程中的醇酯含量提供技术支持,对黄酒发酵菌种资源的开发利用以及黄酒品质的提升具有参考价值。后续研究中,有望结合其他组学技术,进一步拓展对微生物之间复杂相互作用机制的研究。

制作：路旭东

编辑：张逸群、李宁

审核：叶红波