宁夏大学张军翔教授等：3株商业克鲁维酵母对贺兰山东麓赤霞珠干红葡萄酒增酸效果及酒品质的影响

葡萄酒的发酵过程主要由酿酒酵母主导,而非酿酒酵母起到辅助作用的微生物互作过程。酿酒酵母具有旺盛的发酵力和高度的胁迫耐受性,但通常它们酿造产生的葡萄酒风味较为单一。相对而言,非酿酒酵母具有独特的生理代谢途径和胞外酶,这些特性有助于稳定酿造出的葡萄酒颜色、增强酒的香气以及调控产生其他代谢产物^[1]。例如,粟酒裂殖酵母通过其代谢活动可以产生丙酮酸和乙醛,这些物质能与花色苷进行吡喃化反应,聚合生成吡喃花色苷,进而提升葡萄酒颜色的稳定性^[2];有孢汉逊酵母则能显著提高葡萄酒中萜烯和乙酯的含量,这有助于香气的增强^[3];当粟酒裂殖酵母与耐热克鲁维酵母结合使用时,它们可以在降解苹果酸的同时产生乳酸,有助于提高酒的品质和口感^[4]。然而,非酿酒酵母的耐受性相对较差,无法独立完成整个发酵过程。因此,采用混合菌种的发酵方法不仅能够保证发酵过程顺利进行,还能有效改善葡萄酒的整体品质。

克鲁维酵母属中乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)与耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)在葡萄酒酿造中具有重要作用。它们通过独特的生理代谢途径,能够将糖分代谢转化为乳酸,成为提升葡萄酒酸度的一种微生物方法^[5]。最初,乳酸克鲁维酵母是从牛奶中分离出来的,其菌落呈乳白色且表面光滑,可以利用广泛的碳源,并且由于其特有的β-半乳糖苷酶和乳糖透性酶,能够代谢乳糖,因此能够以乳糖作为唯一碳源生长繁殖^[6]。通过对降低丙酮酸旁路代谢通量的糖酵解途径进行基因改造,可以增加乳酸的产量^[7]。耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans),曾被称为Kluyveromyces thermotolerans,后经Kurtzman根据基因序列重新将其归类为Lachancea属^[8]。耐热克鲁维酵母可以从自然发酵的葡萄酒、葡萄果实、植物和土壤中分离得到^[9]。在CHROMagar^®显色培养基中,酿酒酵母呈现为紫色,其他大多数非酿酒酵母为乳白色,而耐热克鲁维酵母菌落则表现为红棕色^[10]。耐热克鲁维酵母菌落光滑有光泽,以葡萄糖和蔗糖为主要碳源,因其具有高活性的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH),它能将糖酵解途径中代谢的丙酮酸转化为乳酸,并与乙醇支路竞争,从而高效生产乳酸,降低葡萄酒的 pH 值。同时,由于耐热克鲁维酵母产乙酸量低,有助于稳定葡萄酒颜色并减少乙醇的产量^[11]。因此,采用克鲁维酵母属和酿酒酵母混菌发酵的方式,不仅能够提高葡萄酒的酸度和感官品质,还对改善葡萄酒的整体风味具有积极作用。

赤霞珠葡萄原产于法国的波尔多地区,我国最早于1892年引入并开始栽培。随后,在宁夏贺兰山东麓得到广泛种植,在该地区的栽种面积占据了红色葡萄品种的70%以上^[12]。高品质的赤霞珠干红葡萄酒以色泽浓郁、酸度较高、单宁丰富、结构感强以及耐陈酿的特点而闻名,并带有黑醋栗、青椒、雪松、皮革等香气特征^[13]。然而,近年来由于气候变化,贺兰山东麓产区的赤霞珠葡萄糖度积累过高,而酸度过低,会导致葡萄酒不易储存、味感寡淡、容易出现微生物病害,从而影响了赤霞珠干红葡萄酒的品质。为了解决这一问题,一些研究试图通过利用非酿酒酵母改善原料的高糖低酸状况,一些添加剂公司已经推出了可以增酸的商业非酿酒酵母来调整高糖低酸的状况。因此,本研究以赤霞珠为原料,选取3株商业克鲁维酵母进行发酵实验,在前期研究已确定的较佳接种量和顺序发酵的条件下,探究了这些克鲁维酵母对葡萄酒有机酸组分及质量浓度的影响。同时,分析了葡萄酒的基本理化指标、挥发性香气化合物的种类及含量以及感官品质,以期为商业克鲁维酵母的应用提供详实的数据和技术支持,从而为赤霞珠干红葡萄酒的增酸酿造技术提供参考,为赤霞珠干红葡萄酒品质的提高提供理论依据。

1.1 材料与试剂

葡萄原料。赤霞珠(Cabernet Sauvignon)葡萄,2023年10月4日采自宁夏贺兰山东麓产区宁夏君祥葡萄酒庄,卫生状况良好。基本理化指标:还原糖260.0 g/L,总酸4.68 g/L,pH值3.73。

酵母菌株。酿酒酵母(商品名Excellence XR,简称“XR”);耐热克鲁维酵母Excellence X-FRESH(Lachancea thermoto-lerans,商品名Excellence X-FRESH,以下简称“卓越X”);耐热克鲁维酵母ZYMAFLORE^® OMEGALT(Lachancea thermotolerans,商品名ZYMAFLORE^® OMEGALT,以下简称“ZO”);乳酸克鲁维酵母CVE-7(Kluyveromyces thermotolerans,商品名CVE-7,以下简称“CVE-7”)。

酿酒辅料。果胶酶(商品名Vinozym vintage FCE)、偏重亚硫酸钾,法国LAMOTHE-ABIET公司。

试剂及标准品。L-酒石酸、苹果酸、L-乳酸、柠檬酸、琥珀酸,均为色谱纯,北京索莱宝科技有限公司;甲醇,色谱纯,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;磷酸、氢氧化钠,均为分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司。链长C8～C20的正构烷烃(质量分数≥99.7%,色谱纯),美国Sigma-Aldrich公司;4-甲基-2-戊醇(质量分数≥98.0%,色谱纯),日本TCI公司。乙酸乙酯、丁酸乙酯、异丁酸乙酯、异戊酸乙酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、乳酸乙酯、月桂酸乙酯、己-2-烯酸乙酯、棕榈酸乙酯、乙酸苯乙酯、肉豆蔻酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯、己酸异戊酯、丙酸异戊酯、辛酸甲酯、癸酸3-甲基丁酯、乙基9-癸烯酸酯、1-丁醇、1-壬醇、1-戊醇、2,3-丁二醇、3-甲基-1-戊醇、异丁醇、异戊醇、3-甲硫基丙醇、苯甲醇、正己醇、苯乙醇、乙酸、异丁酸、辛酸、正癸酸、乙醛、癸醛、月桂醛、β-大马士酮、2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、2,6,8-三甲基-4-壬酮、苯乙烯,均为色谱纯,美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

Agilent Technologies 1220 Infinity II型液相色谱仪,配置Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6 mm×250 mm×5 μm分离柱,美国Agilent公司;7890B-7000D型气相色谱-质谱仪(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)联用仪,配置DB-WAX色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Agilent公司;PAL3型自动进样器,瑞士CTC公司;TU-1901型分光光度计北京普析通用仪器有限公司;Enology Y15型全自动葡萄酒分析仪,西班牙Biosystems公司;雷磁PHS-3C型 pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;ZX-1600型光学显微镜,上海光学仪器厂; ME104E型电子分析天平,德国梅特勒-托利多公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酵母的活化及接种方法

酿酒酵母(XR)的活化:按照商业酵母使用说明活化,并调整接种量为1×10⁵ CFU/mL;商业克鲁维酵母的活化:按照商业克鲁维酵母使用说明活化,并调整接种量为1×10⁶ CFU/mL。

1.3.2 葡萄酒的酿造方法

赤霞珠酿酒葡萄除梗破碎压榨后取8 L葡萄醪置于10 L玻璃发酵罐,并添加果胶酶30 mg/L、偏重亚硫酸钾60 mg/L,低温浸渍48 h后,按组接种酵母启动混菌发酵,24～26 ℃控温进行酒精发酵,发酵过程中每天测定葡萄醪比重,比重降低于995以下视为发酵结束,加入80 mg/L 偏重亚硫酸钾终止发酵,将发酵结束的葡萄酒分离澄清稳定装瓶储藏,测定有机酸、pH值、可滴定酸,陈酿3个月后对各发酵组取样测定理化指标、香气成分,并进行品鉴小组品尝评价。每个处理重复3次。

1.3.3 基本理化指标的测定方法

参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》和GB/T 15037—2006《葡萄酒》,测定酒样的残糖(以葡萄糖g/L计)、可滴定酸(以酒石酸g/L计)、挥发酸(以乙酸g/L计)、酒精度、游离SO₂质量浓度;pH值通过pH计测定;多酚、甘油的质量浓度通过全自动葡萄酒分析仪测定。

以葡萄破碎后的固液物质且未接种酵母时的葡萄醪为对照组。

花色苷质量浓度、色度值、色调值参考文献[14]的方法测定,色度值的测定见式(1),色调值的测定见式(2)。

色度值=(A_{420 nm}+A_{520 nm}+A_{620 nm})×10;

(1)

色调值

(2)

式(1)和式(2)中,A_{420 nm}为黄绿色吸光度,A_{520 nm}为紫红色吸光度,A_{620 nm}为蓝绿色吸光度。

1.3.4 葡萄酒中有机酸的测定

参照GB 5009.157—2016《食品安全国家标准 食品中有机酸的测定》,采用液相色谱法测定酒样中有机酸的含量。色谱条件:流动相为体积分数0.1%的磷酸水溶液、体积分数0.1%磷酸的甲醇溶液;流速0.3 mL/min;检测波长210 nm;柱温室温;进样量10.00 μL。

准确称取酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸5种标准品各20.0 mg,用水定容至10 mL,配制质量浓度为2 g/L,按梯度稀释。将5种有机酸的标准品混合后,液相色谱如图1,5种有机酸分离效果较好。

图1 5种有机酸标准品的液相色谱

Fig.1 Liquid chromatograms of five organic acid standards

以每种有机酸标准品质量浓度对峰面积进行线性回归拟合,得到有机酸的标准曲线方程见表1。量取2 mL葡萄酒样品至10 mL容量瓶中,加水定容后混匀,经0.22 μm滤膜过滤,进样10 μL。将样品中有机酸的峰面积分别代入表1中标准曲线,计算有机酸的质量浓度。

表1 5种有机酸标准品的定量回归分析

Tab.1 Quantitative regression analysis of five organic acid standards

1.3.5 挥发性气味化合物的定性和定量分析方法

使用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(head space-solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)技术对葡萄酒中挥发性气味化合物进行检测^[15]。

将5 mL加入了NaCl至饱和的酒样在40 ℃ 250 r/min条件下搅拌振荡并吸附30 min。进样口温度为250 ℃,热解析8 min;样品在高纯氦气作为载气(流速1 mL/min)条件下于毛细管柱上进行分离;气相色谱升温程序起始于50℃保持1 min,以3 ℃/min的速度升温至220 ℃,保持5 min;质谱接口温度为280 ℃,离子源温度为230 ℃,质谱采用70 eV能量的电子轰击源,质量扫描范围为m/z 29～350 u,运行时间63 min。

采用保留指数、质谱(NIST 17谱库)比对、标准化合物比对的方法对挥发性气味化合物进行定性分析。使用标准化合物,以内标-标准曲线法进行定量。对缺少标准品的化合物根据化学结构相似和碳原子数相近的原则进行定量。

参考文献[16-17]的方法,用计算得到的气味化合物的质量浓度除以文献中获得的该物质的阈值,计算气味化合物的气味活性值(odor activity value,OAV),筛选对香气有直接贡献(OAV>1)的香气活性化合物进行分析。

1.3.6 葡萄酒感官评价方法

感官分析参照葡萄酒品尝评分表描述的方法略作改动^[13]。由宁夏大学葡萄酒专业老师和学生组成葡萄酒感官品评小组,共20名(10名男性,10名女性),每名品尝员均经过专业品评培训。以盲品的形式,在标准品酒室(ISO 8589—1998)使用标准品酒杯(ISO 3591—1997)品鉴。

表2是将每种有机酸分别设置为3个不同质量浓度,标注a、b、c。品尝员根据表2对每种有机酸的3个不同浓度进行排序,以此来判断品尝员对酸度的感知是否准确,以及做出的品评结果是否具备可参考性。研究的品尝员共20位,其中准确率在80%以上的有12位,剩余8位准确率较低的品尝员的品鉴结果不做参考。品尝员根据表3对葡萄酒品质进行打分。

表2 不同质量浓度的5种有机酸品尝训练实验设计

Tab.2 Design of five organic acid tasting training experiments with different mass concentrations g/L

a、b、c为不同质量浓度级别。

表3 葡萄酒的感观评分

Tab.3 Sensory rating of wines 分

1.4 数据处理

采用Excel 2019软件进行基本数据统计处理;数据平均值和标准偏差、单因素方差分析的计算通过R软件(版本4.1.2)完成;条形图、堆积图、主成分、雷达图由Origin 2023 b绘制。

2.1 克鲁维酵母顺序发酵对葡萄酒酸度的影响

2.1.1 接种前后葡萄酒中可滴定酸和pH值的测定结果

接种克鲁维酵母前后对葡萄酒可滴定酸、pH值的测定结果见图2。由图2可知,赤霞珠葡萄醪可滴定酸质量浓度低、pH值高,接种3株克鲁维酵母可提高葡萄酒可滴定酸质量浓度0.57%～165.74%,pH值下降0.98%～13.58%。卓越X酒样在混菌发酵24 h后,可滴定酸质量浓度显著高于其他处理组,但发酵后期可滴定酸有所降低;CVE-7酒样在酒精发酵结束后表现较好,可滴定酸质量浓度最高;ZO酒样在混菌发酵24 h后,可滴定酸质量浓度有所升高,但pH值无显著变化,发酵结束后与XR酒样中可滴定酸和pH值接近,并且不具显著差异;卓越X酒样和CVE-7酒样可滴定酸质量浓度显著高于XR酒样和ZO酒样,pH值显著低于XR酒样和ZO酒样,可滴定酸和pH值变化同Jiang的研究一致^[18]。3株克鲁维酵母顺序接种能够增加葡萄酒的可滴定酸含量,降低pH值。其中,卓越X酒样和CVE-7酒样增酸效果最好,卓越X酒样在接种前期增酸效果显著,后期可滴定酸含量稳定,而CVE-7酒样前期增酸平稳,后期增酸效果显著,发酵结束后二者的可滴定酸质量浓度分别为10.99 g/L和12.44 g/L,pH值分别为3.27和3.22;ZO酒样接种前后增酸效果不显著,与XR酒样产酸结果相似。

图2 克鲁维酵母对葡萄酒可滴定酸和pH值的影响

Fig.2 Effect of Kluyveromyces on titratable acid and pH value of wine

2.1.2 接种前后有机酸质量浓度的测定结果

有机酸的质量浓度对葡萄酒风味至关重要。葡萄酒生产中对低酸葡萄原料调酸,以前多以添加酒石酸为主,但酒石酸会导致葡萄酒产酸尖锐、生硬的口感,现在多接种产酸酵母。接种产酸酵母的方法可以提高葡萄酒柔和、圆润的口感和稳定性^[19]。本研究主要分析3株克鲁维酵母发酵对葡萄酒有机酸组分和质量浓度的影响,分析结果见图3。葡萄醪中主要有3种组分分别是酒石酸、苹果酸、柠檬酸,发酵24 h时,产生了乳酸和琥珀酸,酒石酸、苹果酸、柠檬酸保持不变或略有升高,接种克鲁维酵母酒样对比XR酒样均显著增加了乳酸的含量,是XR酒样的2～8倍,特别是卓越X酒样中乳酸的质量浓度达8.18 g/L^[20]。这是因为耐热克鲁维酵母具有高活性的乳酸脱氢酶,能将糖酵解途径产生的丙酮酸转化成乳酸,并与乙醇途径产生竞争^[11],说明3株克鲁维酵母在发酵前期发挥了增酸作用。在酒精发酵结束后,对比XR酒样,各处理组中酒石酸、苹果酸质量浓度均明显降低,柠檬酸的质量浓度保持稳定,琥珀酸质量浓度升高,但乳酸仍然是最主要的有机酸,发酵后期随着酒精度的增加,非酿酒酵母的生长被抑制,同时有机酸作为酿酒酵母的有机碳源之一在发酵后期被消耗,所以苹果酸、酒石酸等被代谢减少,而琥珀酸在三羧酸循环中被积累下来。

图3 克鲁维酵母对葡萄酒有机酸质量浓度的影响

Fig.3 Effect of Kluyveromyces on organic acids mass concentration of wine

2.2 克鲁维酵母顺序发酵对葡萄酒基本理化指标的影响

2.2.1 主要理化指标的测定结果

发酵结束后酒样的主要理化指标分析结果见表4。由表4可知,所有酒样残糖均低于4 g/L,均完成酒精发酵,酒精度在14.5%vol～16.23%vol,卓越X酒样和CVE-7酒样的酒精度显著低于XR酒样和ZO酒样,说明非酿酒酵母的增酸生化途径与乙醇途径产生竞争^[11]。挥发酸是葡萄酒品质的重要评价指标之一,它是微生物代谢的腐败产物之一,因此挥发酸的含量过高会对葡萄酒风味产生负面影响^[21]。GB/T 15037—2006中要求挥发酸接种的葡萄酒低于1.2 g/L,卓越X酒样与CVE-7酒样中挥发酸质量浓度虽然显著高于对照XR酒样和ZO酒样,但均明显低于国标的要求,说明葡萄酒具有较好的稳定性。甘油在葡萄酒发酵过程中由微生物代谢产生,能给葡萄酒带来圆润、醇厚的口感^[13],XR酒样和ZO酒样中的甘油含量高于卓越X酒样和CVE-7酒样,这说明产酸途径并不会影响甘油代谢途径。XR酒样与各处理组酒样中的游离SO₂质量浓度在31.64～35.48 mg/L,并且不存在显著差异,这说明顺序接种克鲁维酵母的酒样在酒精发酵结束后稳定性较好,并且对SO₂具有较好的耐受性。多酚是指一个单一结构中带有多个苯环的一类化合物,包括黄烷-3-醇、单体儿茶素、黄酮醇等^[22]。多酚含量在XR酒样和各处理组间虽然不存在显著差异,但顺序接种克鲁维酵母酒样中的多酚均高于XR酒样,可说明克鲁维酵母混菌发酵可以一定程度上提高葡萄酒对多酚物质的浸渍,从而提高葡萄酒的结构感和抗氧化作用。

表4 发酵结束后葡萄酒的主要理化指标

Tab.4 Main physicochemical indicators of wine after fermentation

不同小写字母表示同行数据差异显著(P<0.05)。

2.2.2 酒体颜色变化的测定结果

颜色是葡萄酒最为直观的特征属性,红葡萄酒呈现红色主要是由于花色苷的存在。花色苷因自身独特的10电子稳定芳香共轭结构,在绿色波长(520 nm)范围具有光谱吸收,所以呈现互补色——红色。色调值表示葡萄酒的颜色深浅;色调值越低代表酒色越呈紫红色色调,色调值越高则逐渐呈现橙黄色调^[23]。图4为各处理组葡萄酒酒样颜色和花色苷含量的测定结果。由图4可知,虽然各处理组间花色苷无显著差异,但花色苷含量均高于XR对照组,说明接种克鲁维酵母进行混菌发酵一定程度上可以提高葡萄酒中对果皮物质的浸渍。顺序接种克鲁维酵母的葡萄酒的色度值显著高于XR酒样,但是接种3株克鲁维酵母的处理组之间无显著差异,说明克鲁维酵母能提高葡萄酒的颜色深度;接种克鲁维酵母的葡萄酒色调值显著低于XR酒样,说明葡萄酒中的红紫色较重。综上,顺序接种克鲁维酵母能够提高葡萄酒的颜色,并且可以呈现较重的紫红色色调,其中卓越X和CVE-7表现最好。

不同小字字母表示组间数据有显著性差异。

图4 克鲁维酵母对葡萄酒颜色和花色苷含量的影响

Fig.4 Effect of Kluyveromyces on color and anthocyanin content of wine

2.3 克鲁维酵母顺序发酵对葡萄酒挥发性气味化合物的影响

2.3.1 香气成分分析

葡萄酒的香气由葡萄自身的品种香、微生物代谢产生的发酵香以及发酵结束稳定后发生的化学反应产生的陈酿香组成^[17,24]。葡萄酒香气是葡萄酒质量的重要指标,香气化合物种类和含量组成复杂,因葡萄品种、工艺条件等造成复杂的香气成分差异,最终对葡萄酒产生积极或消极的影响^[17,22]。酒精发酵结束后对各个处理组酒样进行香气化合物的测定分析,结果见表5。4种酒样中共测得52种香气化合物,其中酯类化合物27种、高级醇13种、脂肪酸4种、醛酮7种和其他化合物1种,以上各类香气化合物在葡萄酒中总质量浓度为111.14～622 636.73 μg/L,以酯类化合物种类最多,高级醇质量浓度最高。XR酒样、卓越X酒样、CVE-7酒样、ZO酒样分别检出27、46、48、41种香气成分,总质量浓度分别为648 200.89、403 813.41、1 065 664.88、835 434.61 μg/L。

表5 克鲁维酵母对葡萄酒香气化合物的影响

Tab.5 Effect of Kluyveromyces on aroma compounds of wine

续表5

续表5

不同小写字母表示同行数据差异显著(P<0.05);Nd为未检出。*MS为质谱鉴定,RI为保留指数鉴定,S为标准品鉴定; ** S为标准品建立的标准曲线定量。

酯类化合物是酒精发酵产生的副产物之一,主要为葡萄酒贡献花果香,葡萄酒中的酯类物质大多形成于微生物发酵和陈酿阶段,主要包括脂肪酸乙酯、乙酸酯类、有机酸乙酯以及内酯类^[22]。各组酒样中酯类物质的总质量浓度在 132 808.04～151 522.44 μg/L,接种克鲁维酵母可以增加酯类物质浓度,相较于XR酒样增加了庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等。卓越X酒样和CVE-7酒样中乳酸乙酯的质量浓度较XR酒样显著增加,主要是因为耐热克鲁维酵母高产乳酸,乳酸与醇发生酯化反应,生成了乳酸乙酯^[25]。

高级醇在葡萄酒中指的是含2个以上C原子的挥发性醇类,是酵母氨基酸通过α-酮酸代谢路径合成和分解产生的副产物^[22,26]。高级醇质量浓度小于300 mg/L时能增加香气复杂度,但是超过400 mg/L,便会带来不愉悦感^[27]。酒样中高级醇质量浓度在349 525.77～623 561.77 μg/L,主要的挥发性气味化合物为异戊醇、异丁醇、苯乙醇等。3株克鲁维酵母对高级醇产量的影响不同(表5^[28-40]),CVE-7酒样可以显著提高高级醇的质量浓度78.4%;相较XR酒样,卓越X酒样和CVE-7酒样可以提高苯乙醇质量浓度的8～10倍。

挥发性脂肪酸能为葡萄酒带来果香、奶酪和脂肪味,低浓度的脂肪酸可以改善香气的复杂性,各组酒样中挥发性脂肪酸质量浓度在165 292.30～303 459.66 μg/L。相较XR酒样,各处理组中脂肪酸质量浓度增加。卓越X酒样和CVE-7酒样中脂肪酸种类和质量浓度增加,主要有乙酸、正癸酸等,ZO酒样中乙酸的质量浓度降低7.73%。接种时间、接种量不同也会导致葡萄酒中的脂肪酸差异很大。

醛酮类化合物来源于发酵代谢途径和醇类氧化途径^[22],酒样中醛酮类化合物质量浓度在4.39～5 406.83 μg/L,相较XR酒样,主要增加的醛酮类化合物为乙醛、癸醛、月桂醛、2,3-戊二酮、2,6,8-三甲基-4-壬酮等,其中,各处理组酒样中β-大马士酮OAV均超过80可以给葡萄酒带来花果香,CVE-7酒样中种类丰富,质量浓度更高。

苯乙烯能为葡萄酒贡献煤油味,并含有乙烯基不饱和键,所以容易发生氧化反应^[22]。相较XR酒样,各处理酒样苯乙烯含量均有所升高,但质量浓度均偏低,并且各酒样OAV均低于1,不被感知,但低浓度的苯乙烯可能在一定程度上提高葡萄酒香气复杂度。

2.3.2 主要香气活性化合物的主成分分析

气味活性值是从香气化合物质量浓度和阈值两个维度共同表征香气活性成分贡献程度的关键指标^[35]。为了更直观区别各处理组间的香气活性成分的差异,对OAV大于1的香气活性化合物进行主成分分析,香气活性化合物载荷及处理组酒样结果见图5。PC1和PC2分别占数据总体方差的37.6%和24.4%,总贡献率为62.0%。由图5可知,XR酒样与PC1、PC2的负半轴相关,主要呈现苯乙醇和异丁醇贡献的花香味,异戊酸乙酯贡献的甜果香,β-大马士酮贡献的甜橙和桃子味;卓越X酒样分布在PC1、PC2的正半轴,主要呈现癸酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、乳酸乙酯、异丁酸乙酯等脂肪酸乙酯贡献的花香、果香、甜香味和乳酪香,2,3-戊二酮呈现的微甜味;CVE-7酒样分布在PC1正半轴PC2负半轴,己酸异戊酯贡献热带果香、癸醛贡献甜橙和橘子香,2,3-丁二酮赋予酒样奶油味,异丁酸贡献黄油、奶酪等味道;ZO酒样分布在PC1负半轴PC2正半轴,乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯贡献新鲜水果和花香,异戊醇带来苦杏仁和指甲油味。主成分分析表明,接种克鲁维酵母对酯类、醇类化合物的提升具有增强作用,提高香气复杂度,尤其是卓越X能够进一步提高赤霞珠干红葡萄酒中花果香。

图5 葡萄酒中OAV大于1的香气活性化合物PCA得分和因子载荷

Fig.5 PCA score and factor loading of aroma active compounds with OAV greater than 1 of wine

2.4 感官评价结果

各酒样感官评价分析结果见图6。由图6可知,各酒样均符合赤霞珠干红葡萄的要求,酒体澄清透明有光泽、呈深紫红色、香气纯正、酒体平衡。3株克鲁维酵母发酵酒样各项表现均优于对照,其中CVE-7酒样颜色最深,紫红色调明亮,卓越X酒样和ZO酒样表现相似;香气方面,各处理组差异较大,卓越X酒样香气得分最高,酯类物质更加丰富复杂,香气浓郁度高,其次是CVE-7,最后是ZO;口感方面,CVE-7酒样酸度最高平衡感最优,余味悠长,卓越X酒样在酸度、结构感、平衡感、余味方面表现好,ZO酒样结构感强;总体评价中,3株克鲁维酵母各方面表现优于XR,得分较高,各处理组较XR酒样,均可增强酒体颜色,提高葡萄酒酸度,增加酒体结构感,提高香气浓郁度,特别是卓越X和CVE-7接种的葡萄酒表现较优。

图6 克鲁维酵母对葡萄酒感观评价得分的影响

Fig.6 Effect of Kluyveromyces on sensory evaluation score of wine

3株商业克鲁维酵母采用10∶1间隔24 h的顺序混菌发酵均可增加赤霞珠干红葡萄酒中可滴定酸和乳酸的含量,同时降低pH值和酒精度,提高多酚和花色苷含量。各处理组较XR酒样都增加了挥发性香气化合物的种类和质量浓度,卓越X酒样中酯类物质较为丰富,带给葡萄酒更馥郁的花香、果香、乳酪香。CVE-7酒样中醛酮类化合物相对更丰富,其酒样呈现更浓郁的热带果香和奶油味;ZO酒样中的香气层次丰富,包括新鲜水果、花香以及苦杏仁和指甲油味。综上,3株商业克鲁维酵母通过混菌发酵工艺能够提高贺兰山东麓赤霞珠葡萄酒中的可滴定酸和乳酸含量,以及香气复杂度,并带来葡萄酒典型的风味特征。研究对商业克鲁维酵母的增酸应用提供了详实的数据和技术支持,可为赤霞珠干红葡萄酒的增酸酿造技术提供参考,为赤霞珠干红葡萄酒品质的提高提供理论依据。

制作：路旭东

编辑：张逸群、李宁

审核：叶红波