渤海大学王胜男教授等：大豆种皮多糖对蛋白乳液凝胶特性及微观结构的影响

大豆分离蛋白(soy protein isolate,SPI)是一种营养价值高、成本低、具有较强的乳化和凝胶能力的植物蛋白^[1]。大豆种皮多糖(soybean hull polysaccharide,SHP)是一种果胶型多糖,具有良好乳化性、凝胶性和增稠性,在乳化食品和凝胶类食品中具有良好的应用前景^[2]。

乳液凝胶是在乳液的基础上通过一定的诱导法形成的具有空间网络结构的凝胶状固体,油脂作为填充物分散在凝胶网络之中,可作为脂肪替代品及递送载体,广泛应用于制药、化妆品和食品行业^[3]。Yang等^[4]利用海藻酸盐与卵清蛋白制备低脂蛋黄酱,与传统全脂蛋黄酱相比,其油脂含量低且具有良好的感官特性。此外,卵清蛋白、菊粉、卡拉胶、玉米醇溶蛋白、壳聚糖等制备的乳液凝胶,可作为肉类脂肪替代物,具有良好的质构特性^[5-7]。甜菜果胶与SPI制备的乳液凝胶的凝胶结构、流变性及热稳定性等均随甜菜果胶添加量的增加而增加^[8]。采用乳清蛋白与壳聚糖、SPI、甜菜果胶制备的乳液凝胶,被用于番茄红素、β-胡萝卜素、核黄素的封装以及输送,能够实现功能因子稳定性的提高和靶向递送^[9-10];但是,探究果胶型多糖与SPI制备乳液凝胶的相关研究较少。

本研究拟通过傅里叶红外变换光谱、扫描电子显微镜和X射线衍射分析不同SHP添加量对乳液凝胶微观结构的影响,并探究不同SHP添加量的乳液凝胶的凝胶强度与储藏稳定性。研究旨在明确SHP对SPI乳液凝胶稳定性的影响,为SHP和SPI乳液凝胶在模拟脂肪、低脂食品中的应用提供理论参考。

1.1 材料与试剂

大豆(黑河43)种皮,辽宁锦州大豆皮经销公司(蛋白质质量分数为12%,纤维质量分数为34%、水质量分数为14%);SPI,山东禹王生态食业有限公司(蛋白质质量分数为90%);大豆油,黑龙江九三食品股份有限公司;无水乙醇、草酸铵,分析纯,天津市东天正精细化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

JA5002型精密电子天平,北京海天友诚科技有限公司;Scitar2000型傅里叶变换红外光谱仪,美国安捷伦公司;JSM-6490LV型扫描电子显微镜,日本电子株式会社;DHR-1型旋转流变仪,美国TA公司;AD300S-H型高速分散均质机,上海昂尼仪器仪表有限公司;TA.X T-Plus型质构仪,英国微讯公司;Rigaku Ultima Ⅳ型X-射线散射仪,日本理学研究所扶桑工业株式公社;SHJ-6A型磁力搅拌水浴锅,金坛精达仪器制造有限公司;L-535R型离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司;52AA型旋转蒸发仪,郑州生化仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 SHP的制备

参考Yang等^[11]的方法提取SHP,透析后冻干,置于4 ℃保存。

1.3.2 不同SHP添加量的乳液凝胶制备

将SHP分散在去离子水中,配制成质量浓度为60 mg/mL的SHP溶液,4 ℃水合过夜。将8 g SPI分别分散在80.0、77.5、75.0、72.5、70.0 mL的去离子水中,室温下磁力搅拌3 h,水合过夜。分别将2.5、5.0、7.5、10.0 mL SHP溶液添加到77.5、75.0、72.5、70.0 mL 的SPI溶液中,75 ℃下搅拌25 min,自然冷却,再分别加入20 mL大豆油,利用高速分散均质机7 000 r/min剪切2 min。制备的乳液凝胶中SPI质量浓度均为80 mg/mL,SHP质量分数分别为0.15%、0.30%、0.45%、0.60%。以相同质量浓度的SPI乳液凝胶为空白对照。

1.3.3 乳液凝胶流变学特性的测定

参考Bi等^[12]的方法,取3 mL乳液凝胶于旋转流变仪的样品台上,使用40 mm平行板,间隙设置为1 000 μm,剪切速率为0.01～100 s^-1,检测乳液凝胶的稳态流变特性。利用Herschel-Bulkley模型拟合数据。

参考Zhang等^[13]的方法,应变设定为0.4%,角频率为0.1～100 rad/s,测定乳液凝胶的储存模量(G′)、损耗模量(G″)。

参考Shahbazi等^[14]的方法,持续施加10.0 Pa的压力于凝胶样品,记录10 min内的形变量作蠕变曲线。撤销施加的压力,记录10 min内的形变量作恢复曲线。

1.3.4 乳液凝胶结构的分析

参考Zhang等^[10]的方法,将冻干后的样品与溴化钾以质量比1∶100混合并研磨均匀,压片后放入样品槽中,进行红外光谱分析。扫描波数为4 000～400 cm^-1,在4 cm^-1分辨率下,连续扫描64次。

1.3.5 乳液凝胶微观结构的观察

参考Dai等^[15]的方法,将1.3.2节中大豆油替换为挥发性的环己烷,制备乳液凝胶,经冻干后,在其截面喷金。采用扫描电子显微镜(放大1 000倍)观察凝胶截面的微观结构。

1.3.6 乳液凝胶强度的测定

参考Zhang等^[16]的方法,25 ℃环境下,使用质构仪测定乳液凝胶强度,探头P/0.5,测试速度为 2 mm/s,测试深度为10 mm。

1.3.7 乳液凝胶晶体结构的测定

参考Liu等^[17]的方法,将环己烷代替油相的凝胶冻干样品研成粉末,采用X射线衍射仪进行晶型测试,测试条件为电压40 kV,衍射角(2θ)范围设置为5 °～50 °。

1.4 数据处理

实验数据以平均值±标准偏差表示,采用Origin 2021软件绘图,SSPS 19.0 软件进行差异分析,P<0.05表示差异显著。

2.1 SHP对乳液凝胶流变学特性的影响

2.1.1 SHP对乳液凝胶表观黏度的影响

利用Herschel-Bulkley模型进行非线性回归分析,模型参数见表1。其中K为一致性系数,n为流动特性指数^[12]。由表1可知,数据拟合效果较好(R²大于0.9),且n值小于1。实验结果证明,乳液凝胶属于非牛顿流体^[18]。不同SHP添加量的乳液凝胶的表观黏度随剪切速率的变化,见图1。由图1可知,不同SHP添加量的乳液凝胶均表现出剪切稀化现象,为非牛顿流体^[12]。乳液凝胶表观黏度变化的原因可能是随着剪切速率的增加,乳液凝胶内的SPI或SPI/SHP聚集体逐渐变形,导致分子内或分子间的相互作用被破坏,流动阻力降低,导致其黏度降低^[19-20]。随着SHP添加量的增加,乳液凝胶的表观黏度增加,SPI-SHP乳液凝胶的假塑性持续增加。SHP增加凝胶中油滴的覆盖率,导致液滴间的空间或静电斥力增加及液滴间聚集减少。SHP的亲水和疏水基团,如SHP分子中半乳糖醛酸的羧基与乙酰基,与SPI和油滴之间相互作用形成堆积紧密、牢固的网状结构。因此,SHP在改善SPI乳液凝胶的流体性质方面发挥了重要作用^[18,21]。Wang等^[1]的研究表明:大豆多糖添加量的增加提高了酸诱导的SPI凝胶的黏度;当大豆多糖质量分数为0.5%时,凝胶的黏度为100 Pa·s。当SHP质量分数为0.45%时,乳液凝胶的表观黏度达到最大值;但是,当SHP质量分数为0.60%时,乳液凝胶的表观黏度降低。2种SHP添加量对黏度产生的影响不同的原因可能是随着SHP添加量增加,SPI与SHP之间的分子间作用力和氢键作用增强,形成的凝胶网络更加坚固。因此,在高速剪切过程中产生较大的阻力,导致乳液凝胶中油滴的大小和分布不均一,形成团聚块,乳液凝胶的黏度降低。

图1 SHP添加量对乳液凝胶表观黏度的影响

Fig.1 Effect of SHP addition on apparent viscosity of emulsion gels

表1 SHP添加量对乳液凝胶Herschel-Bulkley模型参数的影响

Tab.1 Effects of SHP addition on Herschel-Bulkley model parameters of emulsion gels

2.1.2 SHP对乳液凝胶黏弹性的影响

通过频率扫描分析乳液凝胶在不同振荡频率下的流变特性,可以反映其网络结构与交联程度的变化。不同SHP添加量对乳液凝胶黏弹性的影响见图2。由图2可知,随着角频率增加,未添加SHP的乳液凝胶的G″、G′值变化趋势相似,且G′值大于G″值,呈稳定的凝胶状态。当角频率超过35 rad/s时,乳液凝胶G′值呈下降趋势,且G″值大于G′值。黏弹性数据表明,SPI乳液凝胶中出现类似液体的状态^[22]。但是,随着角频率增加,添加SHP的乳液凝胶的G′、G″值均增加,表现出频率依赖性^[12]。随着SHP添加量的增加,乳液凝胶的G′、G″值增大。凝胶黏弹性变化的原因可能是随着SHP含量增加,疏水和亲水基团(乙酰基和羧基)的含量增加,导致油水界面上结合位点增加,液滴间氢键与分子间相互作用增强,凝胶网络结构更加坚固,乳液凝胶的力学稳定性增强^[14]。Feng等^[23]研究发现,当甜菜果胶质量分数为1%时,凝胶G′值为100 Pa,随着甜菜果胶质量分数从1%增加到6%,SPI乳液凝胶的G′、G″值均增加。本研究添加质量分数为0.60% SHP的乳液凝胶中氢键作用与分子间相互作用增强,凝胶G′值超过100 Pa,凝胶的网络结构较强。

实心符号表示G′,空心符号表示G″。

图2 SHP添加量对乳液凝胶G′和G″的影响

Fig.2 Effect of SHP addition on G′ and G″ of emulsions gel

2.1.3 SHP对乳液凝胶蠕变恢复特性的影响

蠕变分析通过施加应力使样品快速变形,通常用于评价样品的瞬间黏弹性特征。不同SHP添加量的乳液凝胶蠕变阶段的应变随时间的变化见图3。由图3可知,在0～600 s,当乳液凝胶受到恒定的应力时,其形变随着时间的延长而增大。随着SHP添加量的增加,乳液凝胶的总形变逐渐减小,乳液凝胶的抗蠕变性能增加,可能是SHP增强了乳液凝胶的网状结构^[12]。在601～1 200 s内,当乳液凝胶所受应力消除后,乳液凝胶的形变随时间的增加而减小,减小到一定值后保持不变,表明乳液凝胶存在黏性流动特性,仍有一部分形变无法恢复。乳液凝胶的蠕变恢复特性变化见图3。由图3可知,随着SHP添加量的增加,乳液凝胶的峰值大幅降低,乳液凝胶的总形变减少,表明乳液凝胶流动性较低。SHP与SPI之间的氢键、分子间相互作用增强,使得凝胶网络结构强度逐渐增加^[24]。Chang等^[25]研究黄原胶和瓜尔胶对葡萄糖内酯制备的SPI凝胶的影响,也发现凝胶形变量随黄原胶和瓜尔胶含量增加而减小。

图3 SHP添加量对乳液凝胶蠕变恢复特性的影响

Fig.3 Effect of SHP addition on creep recovery properties of emulsion gels

乳液凝胶的相对回收率为消除剪切应力后凝胶的变形程度与最大变形点之比,反映乳液凝胶的蠕变恢复能力。不同SHP添加量的乳液凝胶的最大变形点、恢复期后的变形程度以及相对回收率见表2。其中,J_m为最大蠕变,J_e为恢复后的平衡蠕变顺应性。由表2可知,随着SHP添加量的增加,乳液凝胶的回收率逐渐增加,凝胶的弹性增强、自支撑性能增强^[21]。当SHP质量分数为0.45%、0.60%时,SHP-SPI乳液凝胶的相对回收率分别为45.86%、47.56%,明显高于SPI乳液凝胶的0.60%。当SHP质量分数为0.15%、0.30%时,SHP-SPI乳液凝胶的相对回收率分别为26.03%、35.19%,相对较差。SHP-SPI乳液凝胶回收率变化的原因可能是加入SHP后,乳液凝胶的凝胶网络结构可逆性增强^[26]。蠕变恢复结果表明,添加了SHP的乳液凝胶中形成了一个可逆的网络结构,形变后可部分恢复其初始结构^[21]。Bi等^[12]研究亚麻胶对酸制备SPI凝胶性能的影响,结果显示,凝胶的相对回收率随亚麻胶添加量增加而增加。

表2 SHP添加量对乳液凝胶回收率的影响

Tab.2 Effects of SHP addition on recovery rates of emulsion gels

顺应性常用于表征恒定应力和去除剪切应力后样品的黏弹性变化。不同SHP添加量乳液凝胶的顺应性随时间变化见图4。由图4可知,随着SHP添加量的增加,乳液凝胶的蠕变顺应值逐渐降低,由0.28 Pa^-1下降到0.10 Pa^-1,乳液凝胶的柔韧性逐渐降低,原因可能是SHP含量增加,使乳液凝胶中分子的取向性增强,分子链之间连接率增加,乳液凝胶中形成更强的网络结构。Bi等^[27]研究刺槐豆角对酸制备SPI凝胶性能的影响,发现凝胶的顺应性随刺槐豆角添加量增加而降低,顺应值为0.000 4～0.001 2 Pa^-1。

图4 SHP添加量对乳液凝胶顺应性的影响

Fig.4 Effect of SHP addition on compliance of emulsion gels

2.2 SHP对乳液凝胶基团相互作用的影响

红外光谱中峰的位置、强度及形状的变化可反映聚合物分子间的相互作用。不同SHP添加量的乳液凝胶的傅里叶红外变换光谱见图5。由图5可知,蛋白质在红外光谱上主要有2组特征吸收峰,1 600～1 700 cm^-1波数处的吸收峰为蛋白质酰胺Ⅰ带的—N—H弯曲振动,1 450～1 550 cm^-1
波数处的吸收峰为蛋白质酰胺Ⅱ带的—C—N伸缩振动,1 200～1 450 cm^-1波数处的吸收峰为蛋白质酰胺Ⅲ带的—C—N伸缩振动和—N—H弯曲振动,3 100～3 400 cm^-1波数处的吸收峰为氢键^[28]。1 000～2 000 cm^-1波数处,乳液凝胶在1 163、1 240、1 465、1 543、1 653、1 746 cm^-1
波数处共6个特征吸收峰。1 653 cm^-1波数处特征吸收峰为酰胺Ⅰ带的—C—O伸缩振动,1 543 cm^-1波数处特征吸收峰为酰胺Ⅱ带的—C—N伸缩振动和—N—H弯曲振动,1 240 cm^-1波数处特征吸收峰为酰胺Ⅲ带的—C—N伸缩振动,1 163 cm^-1波数处特征吸收峰为—C—C的伸缩振动^[24,28-29]。1 746、1 465 cm^-1波数处特征吸收峰为—C—O拉伸和—CH₂弯曲振动,可能是存在甘油三酯的羰基、—CH₂和—CH₃等^[30]。位于2 927、2 855 cm^-1波数处的2个相对较小的特征吸收峰为—CH的拉伸振动和—CH₂的不对称伸缩振动。随着SHP添加量的增加,—CH的伸缩振动峰增大,乳液凝胶中—OH的拉伸的峰值位置向更高的波数移动,可能是由于SPI上的酰胺基和SHP中的半乳糖醛酸上的羧基形成了氢键^[10-11,31]。另一方面,酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带峰强度的变化说明蛋白质的二级结构发生了改变。Dai等^[15]研究的玉米醇溶蛋白和阿拉伯胶制备乳液凝胶结构变化趋势与本研究结论相似。

图5 SHP添加量对乳液凝胶红外光谱的影响

Fig.5 Effect of SHP addition on FTIR spectroscopy of emulsion gels

2.3 SHP对乳液凝胶微观结构的影响

不同SHP添加量乳液凝胶微观结构的扫描电镜结果见图6。由图6可知,乳液凝胶均呈现多孔结构,且孔洞大小存在差异。随着SHP添加量的增加,孔洞直径逐渐减小,孔洞大小更加均匀。当SHP质量分数为0.45%时,孔洞直径最小,更加均匀,原因可能是添加SHP后,疏水基团含量增加,使油滴表面的SPI与SHP相互作用增强。同时,游离蛋白与界面蛋白的相互作用使油滴更稳定。此外,随着SHP添加量增加,液滴直径减小,油滴与SPI和SHP的接触面积增大,分子间更易聚集,形成更致密的凝胶结构^[10,32]。Li等^[33]研究海藻酸盐对酪蛋白乳液凝胶的影响,结果显示,随着海藻添加量的增加,乳液凝胶网络孔洞减小且逐渐有序,出现了网状多孔结构。但是,当SHP质量分数为0.60%时,孔洞突然增大且大小不均匀,原因可能是SHP和SPI之间相互作用增强,凝胶网络更加坚固,剪切时阻力较大,油滴分布不均匀。微观结构分析的结果与流变特性结果吻合。

图6 SHP添加量对乳液凝胶微观结构的影响

Fig.6 Effect of SHP addition on microstructure of emulsion gels

2.4 SHP对乳液凝胶强度的影响

不同SHP添加量乳液凝胶的凝胶强度变化见表3。由表3可知,随着SHP添加量的增加,乳液凝胶的凝胶强度增加,二者呈正相关。当SHP质量分数为0.45%、0.60%时,乳液凝胶的凝胶强度显著增加(P<0.05)。随着SHP添加量的增加,疏水的乙酰基和亲水的羧基含量增加,油滴、SPI、SHP之间的氢键作用、疏水作用增强,形成了更加致密、均匀的乳液凝胶网络结构,使凝胶强度增大,凝胶强度结果与频率扫描结果一致^[10]。Xu等^[34]研究菊粉对豌豆蛋白乳液凝胶的影响,结果显示,随着菊粉添加量的增加,乳液凝胶的凝胶强度增加。

表3 SHP添加量对乳液凝胶强度的影响

Tab.3 Effects of SHP addition on gel strength of emulsion gels

不同字母表示同行数据差异显著(P<0.05)。

2.5 SHP对乳液凝胶晶体结构的影响

X射线衍射分析常用于表征样品的晶体结构及结晶度的变化规律。不同SHP添加量乳液凝胶的衍射分析见图7。由图7可知,5种样品均在2θ约为21°处有一个明显的宽衍射峰,说明分子链间距值呈近似正态分布^[35]。实验结果表明,乳液凝胶的聚集态为非晶态(无定形态)结构。与未添加SHP的乳液凝胶相比,SHP质量分数为0.15%、0.30%、0.45%、0.60%的乳液凝胶的衍射峰的2θ增加,乳液凝胶的晶体尺寸减小。当SHP质量分数为0.45%时,样品结晶度由14.86%提高到24.00%。乳液凝胶晶体结构变化的原因可能是添加的SHP与SPI结合,破坏了蛋白质分子原有的规则排列,降低了蛋白质的刚性结构,导致乳液凝胶的晶体尺寸减小^[10,36-37]。Bi等^[12]研究果胶与蛋白质构成的乳液凝胶,结果显示,SPI与果胶结合程度增加,乳液凝胶的结晶度增加,从22.7%提高到26.4%,晶体尺寸减小。

图7 SHP添加量对乳液凝胶晶型的影响

Fig.7 Effect of SHP addition on crystal form of emulsion gels

2.6 SHP对乳液凝胶储存稳定性的影响

不同SHP添加量的乳液凝胶储存7 d后的外观见图8。由图8可知,室温储存7 d后,未添加SHP的乳液凝胶结构松散,凝胶性降低,流动性增大且有水分析出。当SHP质量分数为0.45%、0.6%时,储存后的凝胶的流动性未发生明显变化,仅少量水析出。实验结果说明,SHP显著改善了乳液凝胶的储存稳定性。

图8 SHP添加量对乳液凝胶储存稳定性的影响

Fig.8 Effect of SHP addition on storage stability of emulsion gels

研究分析了不同SHP添加量对乳液凝胶的结构、凝胶性能和稳定性的影响。研究发现,随着SHP添加量的增加,乳液凝胶表观黏度增加,G′、G″值显著提高,凝胶强度明显增加,这可能是由于分子间与氢键作用增强导致乳液凝胶的凝胶网络更加致密。不同SHP添加量的乳液凝胶的相对回收率随SHP添加量的提高而增加,凝胶网络的恢复性逐渐增强。储存7 d后,SHP质量分数为0.45%的乳液凝胶稳定性最好。果胶类多糖SHP可提高SPI乳液凝胶的黏弹性、蠕变恢复性、凝胶强度与储存稳定性。研究旨在为SHP在构建SPI乳液凝胶体系中的开发和应用提供理论参考。

制作：路旭东

编辑：张逸群、李宁

审核：叶红波