北京工商大学庄帅讲师等：草鱼腐败菌P. putida和S. putrefaciens互作对其致腐能力的影响

草鱼是我国产量最高的淡水鱼,2022年全国草鱼养殖产量已达590.48万t^[1]。然而,草鱼等淡水鱼的生鲜鱼肉由于具有营养丰富、水分活度高、pH值近中性等特点,贮藏期间易因微生物的生长繁殖发生腐败变质^[2-4],一定程度上影响了水产品贮藏加工产业的发展。

微生物对鱼肉蛋白质的降解破坏是导致鱼肉腐败的主要原因^[5]。在贮藏期间,微生物首先通过分泌蛋白酶和肽酶将鱼肉中的蛋白质水解为肽类和游离氨基酸,并进一步将游离氨基酸降解为游离氨、生物胺等小分子代谢产物,最终导致鱼肉腐败^[5-6]。前期研究发现,游离氨主要是在微生物氨基酸脱氨酶的作用下由游离氨基酸降解生成^[7]。腐胺主要由微生物通过精氨酸脱亚胺酶(argininedeiminase,ADI)途径降解精氨酸和鸟氨酸生成(精氨酸→瓜氨酸→鸟氨酸→腐胺)^[7-8]。鱼肉中可溶性肽、游离氨和腐胺的含量与微生物的代谢活动密切相关^[9-11],因此,科学研究中常使用可溶性肽、游离氨和腐胺的含量作为评价微生物致腐能力的指标^[5,15]。

腐败微生物间的互作效应是影响微生物生长速率和致腐能力的重要因素^[6,16]。现有研究表明,Pseudomonasputida(P.putida)和Shewanellaputrefaciens(S.putrefaciens)是草鱼中降解鱼肉蛋白、导致鱼肉腐败的主要微生物^[5,7]。S.putrefaciens具有较强的水解鱼肉蛋白、释放可溶性肽和游离氨基酸的能力,而P.putida可以快速降解肽类和氨基酸产生游离氨^[5,7]。在生成腐胺方面,P.putida可通过ADI途径大量降解精氨酸生成瓜氨酸、鸟氨酸,而S.putrefaciens可以利用瓜氨酸和鸟氨酸作为底物大量产生腐胺^[7]。然而,S.putrefaciens和P.putida共存时是否会通过代谢能力互补共同加速鱼肉品质劣变还有待进一步探究。

为验证P.putida和S.putrefaciens间的互作效应,本研究拟将P.putida和S.putrefaciens单独和混合接种至无菌鱼肉,通过测定两菌混合接种对鱼肉贮藏期间腐败菌菌落总数、可溶性肽含量、游离氨含量和腐胺含量的影响,分析P.putida和S.putrefaciens间潜在互作效应对两菌生长速率和致腐能力的影响。研究以微生物互作效应为切入点探究水产品腐败菌的致腐机理,旨在充实水产品保鲜和腐败菌控制技术的研发理论基础。

1.1材料与试剂

菌株P.putida、S.putrefaciens,前期研究分离获得^[5]。草鱼(Ctenopharyngodonidella),体长(50.9±1.0)cm、体质量(1.46±0.09)kg,北京健翔桥农贸市场。甲醛溶液,分析纯,西陇化工股份有限公司;胰蛋白胨大豆肉汤(trypticsoybroth,TSB)、平板计数琼脂,北京奥博星生物技术有限公司;铬天青琼脂,北京酷来搏科技有限公司;柠檬酸三铁、Lowry法蛋白浓度测定试剂盒及配制精氨酸溶液所用的L-精氨酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)、5′-二磷酸腺苷(ADP)(生物技术级),北京索莱宝科技有限公司;氨测定试剂盒(谷氨酸脱氢酶法),湖南永和阳光生物科技股份有限公司;二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠,分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

LC-16型高效液相色谱系统(配有COSMOSIL5C18-PAQ液相色谱柱),日本岛津公司;Supermax3000AL型多功能酶标仪,上海闪谱生物科技有限公司。

1.3实验方法

1.3.1无菌鱼肉的制备

鲜活草鱼使用敲击头部法击晕后,刮鳞去脏,并用自来水洗净鱼体表面和体腔内的血水和黏液。使用医用酒精棉球充分擦拭草鱼体表,并用无菌吸水纸吸干鱼体表面水分。随后使用无菌刀片割取草鱼背部肉并置于无菌均质袋中。取肉结束,将背部肉置于铺有无菌纱布的超净工作台内(鱼皮向下,鱼肉向上摆放),打开无菌空气和紫外灯照射20～30min,以进一步吹干鱼肉表面水分并对鱼肉表面进行杀菌。处理结束后,用无菌刀具剥去鱼皮及暗色肉,并将白色肉切分成约3cm×2cm×2cm的肉块(每条鱼可取14～17块)。约每40块鱼肉置于一个无菌均质袋中,加入500mL5g/L的甲醛溶液浸洗40s[鱼肉与甲醛溶液料液比(g/mL)为1∶1],以充分杀灭鱼肉中的残留微生物。浸洗完成后立即倒掉沥干甲醛溶液,并加入500mL无菌去离子水洗涤鱼肉60s以去除残留的甲醛。去离子水清洗步骤需重复操作3次。洗涤完成的无菌鱼肉置于4℃冰箱内暂存,并于4h内完成鱼肉腐败菌回接。

1.3.2腐败菌的活化与回接

将分离获得的P.putida和S.putrefaciens菌株置于TSB中30℃培养12h进行活化。随后吸取各菌株的培养液,以0.5%接种量再次接种于新鲜TSB中,100r/min水浴摇床30℃培养至菌落总数约9.0lg(CFU/g)。使用无菌生理盐水将细菌培养液稀释50倍,即为细菌接种液。

将制得的无菌鱼肉分为对照组(无菌生理盐水)、P.putida组、S.putrefaciens组和混合接种组。混合接种液由P.putida接种液和S.putrefaciens接种液按活菌总数约1∶3配制。鱼肉与接种液料液比(g/mL)为1∶1,浸泡10min进行接种。接种完成后沥干接种液,各组中每5块鱼肉置于同一无菌包装袋中进行冷藏[(4±1)℃]。在冷藏的第0、4、8、11、14天,各组分别随机选取3袋样品(3个平行)进行菌落总数和理化指标检测。

1.3.3鱼肉样品中P.putida和S.putrefaciens菌落总数的测定

根据Zhuang等^[15]的平板涂布法测定鱼肉样品中P.putida和S.putrefaciens的菌落总数。P.putida(小的白色不透明菌落)和S.putrefaciens(浅粉色半透明菌落)在平板计数琼脂上的菌落特征具有明显区别,因此对于混合接种组样品可通过肉眼对P.putida和S.putrefaciens菌落总数分别进行计数。

1.3.4P.putida和S.putrefaciens产嗜铁素能力的测定

按照产品说明书制备铬天青琼脂平板(100g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、0.5g/LMgSO₄·7H₂O、0.5g/LCaCl₂、20g/L琼脂、0.06g/L铬天青磺酸盐、0.0027g/LFeCl₃·6H₂O、0.073g/L溴化十六烷基三甲基铵),随后将10μL1.3.2节中制备的P.putida和S.putrefaciens接种液注入铬天青琼脂表面下约1mm深处进行接种。接种后的铬天青琼脂平板4℃培养5d,通过测定琼脂表面菌落和铁离子螯合圈(环绕菌落的浅黄色透明圈)的大小,判断P.putida和S.putrefaciens的产嗜铁素能力。

1.3.5鱼肉样品中理化指标的测定

使用榨汁机将各袋鱼肉样品分别绞碎,并测定鱼肉中游离氨、腐胺和可溶性肽的含量。游离氨含量的测定使用氨测定试剂盒进行,结果表示为mmol/100g。

可溶性肽含量的测定参照Zhuang等^[15]的方法,称取3.0g绞碎的鱼肉同27.0mL50g/L的三氯乙酸溶液在冰水浴中匀浆。匀浆液在冰水浴中静置平衡30min后,12000r/min离心5min去除蛋白质沉淀。使用Lowry法蛋白浓度测定试剂盒检测上清液中可溶性肽含量,并以酪氨酸为底物建立标准曲线,鱼肉中可溶性肽含量以酪氨酸当量计(μmol/g)。

鱼肉中腐胺的提取:将5.0g绞碎的鱼肉同10.0mL0.6mol/L的高氯酸溶液在冰水浴条件下匀浆。匀浆液10000r/min离心5min,收集上清液。沉淀用10.0mL高氯酸溶液振荡洗涤1遍,再次离心。合并2次离心所得上清液,并用高氯酸溶液定容至25mL。腐胺质量比(mg/kg)的检测采用Zhuang等^[15]的高效液相色谱法。

1.3.6ADI途径中P.putida和S.putrefaciens互作关系的验证

将P.putida和S.putrefaciens单独和共同接种于精氨酸溶液(5.0mmol/LL-精氨酸、50μg/mLNAD⁺和50μg/mLADP溶于0.045mol/L的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液中并调至pH值为7.50)中并进行培养。通过测定2种腐败菌降解精氨酸后的腐胺产量,验证ADI途径中P.putida和S.putrefaciens的互作关系。腐败菌的接种和培养参照Zhuang等^[7]的方法并适当改进。首先,将腐败菌P.putida和S.putrefaciens于TSB中30℃培养12h进行活化。由于TSB同鱼肉的营养组成不同,因此实验将活化后的腐败菌培养液再次接种于无菌鱼汁中进行培养(接种量0.4%),使腐败菌达到和在鱼肉中生长时相似的代谢状态。鱼汁中的腐败菌在100r/min水浴摇床30℃培养至约9.0lg(CFU/g)即为细菌接种液。随后,P.putida组、S.putrefaciens组和混合接种组按照V(精氨酸溶液)∶V(细菌接种液)=5∶1的比例依次接种P.putida接种液、S.putrefaciens接种液和混合接种液。接种完成的精氨酸溶液4℃培养7d后,向其中加入4倍体积的0.6mol/L高氯酸溶液以沉淀菌体。离心去除提取液中的菌体沉淀,上清液中的腐胺质量浓度按照Zhuang等^[15]的方法进行检测,并换算为精氨酸溶液中的腐胺质量浓度(mg/L)。

1.4数据处理

使用Excel2019计算数据,结果表示为平均值±标准偏差。使用SPSS22.0中的最小显著差法(LSD)对各组数据间的差异显著性进行多重比较分析,显著水平统一设为P<0.05。

2.1P.putida和S.putrefaciens互作对两菌生长速率的影响

P.putida和S.putrefaciens单独和混合接种至草鱼鱼肉时的生长情况见图1。由图1可知,P.putida和S.putrefaciens单独接种时的菌落总数分别为6.48、6.83lg(CFU/g),至贮藏第14天分别生长至9.64、9.49lg(CFU/g)。在冷藏草鱼的自然腐败过程中,新鲜鱼肉的初始微生物数量约4lg(CFU/g);当微生物数量生长至约8lg(CFU/g)时,鱼肉出现腐败迹象^[4,15,17-19]。然而,相比鱼肉中的复杂微生物群落,单一微生物回接时其致腐能力较弱,一般需要菌落总数大于9lg(CFU/g)后才会导致鱼肉发生腐败^[11,20-21]。因此,为充分表征P.putida和S.putrefaciens的代谢特性和致腐能力,本研究采用较高的初始接种量,并冷藏14d至鱼肉腐败。

P.putida、S.putrefaciens、Cocktail-P和Cocktail-S分别表示P.putida组鱼肉中P.putida的菌落总数、S.putrefaciens组鱼肉中S.putrefaciens的菌落总数、混合接种组鱼肉中P.putida的菌落总数和混合接种组鱼肉中S.putrefaciens的菌落总数。

图1P.putida和S.putrefaciens单独和混合接种至草鱼鱼肉时的生长情况

Fig.1GrowthofP.putidaandS.putrefaciensinoculatedaloneortogetheringrasscarpflesh

在混合接种组中,P.putida生长较快,至贮藏结束时已达9.33lg(CFU/g)。然而,混合接种组中S.putrefaciens的生长速率明显较低。至贮藏结束时,混合接种组S.putrefaciens的菌落总数仅为8.58lg(CFU/g),比S.putrefaciens单独接种的菌落总数低近1lg(CFU/g),表明贮藏期间S.putrefaciens的生长受到P.putida的抑制。本研究预实验数据也表明:当S.putrefaciens的初始接种量不足P.putida初始接种量的1/3时,S.putrefaciens因受P.putida抑制等原因无法在鱼肉中正常生长,至贮藏第14天已不能通过平板涂布法同P.putida一起检出。因此,本研究使用S.putrefaciens∶P.putida活菌总数之比为3∶1的接种液对混合接种组进行接种。此外,无菌对照组鱼肉中的菌落总数在整个实验期间均低于检测限[2.00lg(CFU/g)],表明实验过程中无杂菌干扰。

Gram等^[16]前期报道称,低铁含量环境中部分Pseudomonasspp.可通过竞争三价铁离子抑制S.putrefaciens的生长。因此,本研究依据Gram等^[22]的方法进行改进,制备添加120μmol/kg柠檬酸三铁的无菌鱼肉,并进一步测定2种腐败菌在添加柠檬酸三铁鱼肉中的生长速率(图2)。结果表明,添加柠檬酸三铁的鱼肉中P.putida对S.putrefaciens的抑制作用消失,贮藏结束时S.putrefaciens的活菌总数[9.80lg(CFU/g)]甚至超过了P.putida[9.20lg(CFU/g)]。这证明草鱼鱼肉中的P.putida是通过竞争三价铁离子来抑制S.putrefaciens的生长。

图2P.putida和S.putrefaciens混合接种至添加柠檬酸三铁草鱼鱼肉时的生长情况

Fig.2Growthofco-inoculatedP.putidaandS.putrefaciensingrasscarpfleshsupplementedwithferriccitrate

嗜铁素是细菌在低铁含量环境中分泌的一种用于螯合和摄取三价铁离子的有机化合物^[16,23-24]。P.putida和S.putrefaciens在铬天青琼脂平板上的铁离子螯合圈见图3。由图3可知,使用铬天青琼脂平板检测细菌产嗜铁素能力时,铬天青、溴化十六烷基三甲铵和三价铁离子组成一种亮蓝色复合物。当平板中的铁离子被微生物分泌的嗜铁素螯合时,平板颜色变为浅黄色,从而形成菌落周围的铁离子螯合圈。P.putida产生的铁离子螯合圈[直径(9.5±1.5)mm]比S.putrefaciens的[直径(5.3±0.3)mm]更大更明显,表明P.putida具有更强的产嗜铁素和螯合三价铁的能力。同时,P.putida也在铁离子螯合圈周围产生了直径(19.0±2.0)mm的扩散圈,说明P.putida产生的嗜铁素可能更易于在环境中扩散,从而增强P.putida对周围环境三价铁的摄取。由此可见,P.putida可凭借较强的产嗜铁素能力同S.putrefaciens竞争鱼肉中的三价铁离子,从而抑制S.putrefaciens的生长。该结论也一定程度上解释了冷藏草鱼腐败时鱼肉中Pseudomonasspp.较Shewanellaspp.等其他腐败菌具有更高丰度的原因^[5,17-18,25]。

CZ、ICZ和DHZ分别表示菌落、铁离子螯合圈和扩散圈。

图3P.putida和S.putrefaciens在铬天青琼脂平板上的铁离子螯合圈

Fig.3Iron-chelatinghalosformedbyP.putidaandS.putrefaciensonchromeazurolsulphonateagar

2.2P.putida和S.putrefaciens互作对两菌致腐能力的影响

2.2.1对蛋白质水解能力的影响

鱼肉可溶性肽含量是衡量腐败菌水解鱼肉蛋白能力的重要指标^[5,11]。P.putida和S.putrefaciens单独和混合接种时草鱼鱼肉中可溶性肽含量的变化见图4。由图4可知,单独接种P.putida的鱼肉中可溶性肽的质量摩尔浓度变化缓慢,实验期间始终低于2.00μmol/g。接种S.putrefaciens的鱼肉至贮藏结束时产生的可溶性肽(5.52μmol/g)远高于P.putida组,说明相比P.putida,S.putrefaciens是水解鱼肉蛋白、产生游离肽和氨基酸等蛋白质水解物的主要微生物。混合接种组中可溶性肽的质量摩尔浓度在贮藏前11d一直低于2.00μmol/g,至第14天略微上升至2.77μmol/g。这表明P.putida不能促进S.putrefaciens产生可溶性肽,两菌共存时没有增强蛋白质水解能力。

图4P.putida和S.putrefaciens单独和混合接种时草鱼鱼肉中可溶性肽含量的变化

Fig.4ChangesofsolublepeptidescontentingrasscarpfleshinoculatedwithP.putidaandS.putrefaciensaloneortogether

2.2.2对产氨能力的影响

P.putida和S.putrefaciens单独和混合接种时草鱼鱼肉中游离氨含量的变化见图5。由图5可知,P.putida和S.putrefaciens单独接种时均在鱼肉中产生了大量的游离氨。P.putida产生游离氨的能力最强,至贮藏结束时其产生的游离氨质量摩尔浓度达3.33mmol/100g。混合接种组中的游离氨含量在贮藏前11d均高于2个单菌接种组,表明P.putida和S.putrefaciens互作可以共同增强产氨能力,并促进鱼肉中游离氨的生成。然而,混合接种组中的游离氨含量在贮藏最后3d时增长速率较慢,最终仅达到了2.11mmol/100g,低于P.putida单菌回接组。贮藏11d之后混合接种组中游离氨含量增长较慢的原因可能是S.putrefaciens的生长和蛋白水解能力受到了P.putida的抑制,鱼肉中可溶性肽等游离含氮物质的含量相对不足(图4),无法为P.putida释放游离氨提供充足的代谢底物。

图5P.putida和S.putrefaciens单独和混合接种时草鱼鱼肉中游离氨含量的变化

Fig.5ChangesofammoniacontentingrasscarpfleshinoculatedwithP.putidaandS.putrefaciensaloneortogether

2.2.3对产腐胺能力的影响

P.putida和S.putrefaciens单独和混合接种时草鱼鱼肉中的腐胺含量见表1。由表1可知,P.putida单独接种时鱼肉腐胺质量比上升较为缓慢,最终仅达到了5.45mg/kg。S.putrefaciens单独接种时产生的腐胺质量比高达28.00mg/kg(第14天),可见S.putrefaciens相比P.putida是产生腐胺的主要微生物。混合接种组中的腐胺含量在贮藏前8d显著(P<0.05)高于P.putida和S.putrefaciens单菌接种组,表明P.putida确实有助于增强S.putrefaciens的产腐胺能力。然而,贮藏11、14d时,混合接种组中的腐胺含量反而低于S.putrefaciens组,这可能是由于此时混合接种组中S.putrefaciens活菌总数较低(图1),无法产生大量腐胺。

表1P.putida和S.putrefaciens单独和混合接种时草鱼鱼肉中的腐胺含量

Tab.1PutrescinecontentingrasscarpfleshinoculatedwithP.putidaandS.putrefaciensaloneortogether

ND表示未检测到。不同大写字母表示同列数据差异显著(P<0.05),不同小写字母表示同行数据差异显著(P<0.05)。

2.3P.putida和S.putrefaciens互作促进腐胺生成机制分析

借助精氨酸溶液体系检验P.putida促进S.putrefaciens产腐胺的机制,结果见表2。由表2可知,混合接种P.putida和S.putrefaciens的精氨酸溶液中腐胺质量浓度高达29.00mg/L,显著(P<0.05)高于仅接种了S.putrefaciens的溶液(1.45mg/L)和仅接种了P.putida的溶液(0.48mg/L)。这表明P.putida和S.putrefaciens共存时确实可以通过降解精氨酸促进腐胺生成。为验证在精氨酸溶液中P.putida是否是通过精氨酸降解产物而非菌体-菌体相互作用促进S.putrefaciens产腐胺,在培养第4天时使用0.2μm孔径的滤器过滤去除仅接种P.putida的精氨酸溶液中的P.putida菌体,随后接入S.putrefaciens并继续4℃培养。至第7天时,该溶液中的腐胺质量浓度已达14.66mg/L,显著(P<0.05)高于仅接种S.putrefaciens和仅接种P.putida的精氨酸溶液。由此可见,P.putida确实是通过精氨酸降解产物(瓜氨酸、鸟氨酸等)而非菌体间相互作用促进S.putrefaciens产腐胺。

表2接种P.putida和S.putrefaciens的精氨酸溶液中腐胺产量

Tab.2PutrescineproductioninargininesolutionsinoculatedwithP.putidaandS.putrefaciens

不同小写字母表示同列数据差异显著(P<0.05)。

2.4P.putida和S.putrefaciens间的代谢共栖关系分析

代谢共栖是微生物互作的一种重要形式,主要指代谢通路中能力互补的微生物相互配合,借助通路中重要中间产物的传递和共享,最终实现致腐能力的提升^[6,16]。前期研究发现,鱼肉中的P.putida可通过ADI途径大量降解精氨酸生成瓜氨酸、鸟氨酸;而S.putrefaciens可快速降解瓜氨酸和鸟氨酸产生大量腐胺^[7]。在本研究中,S.putrefaciens和P.putida混合接种至鱼肉和精氨酸溶液时的腐胺产量显著(P<0.05)高于接种S.putrefaciens单菌时的腐胺产量(表1和表2)。这表明P.putida和S.putrefaciens可以通过精氨酸降解途径互作,促进鱼肉中腐胺的生成。另一方面,Zhuang等^[5,7]研究表明,S.putrefaciens具有较强的释放可溶性肽和游离氨基酸的能力,而P.putida可以快速降解肽类和氨基酸产生游离氨。本研究中,P.putida和S.putrefaciens互作促进了贮藏前11d鱼肉中游离氨的生成(图5)。但由于混合接种组中可溶性肽的含量较低(图4),因此不足以说明S.putrefaciens是通过为P.putida提供蛋白质水解产物(肽、氨基酸)促进P.putida产生游离氨。此外,S.putrefaciens是产生腐胺的主要微生物;但在贮藏11～14d,混合接种组中的S.putrefaciens生长受到抑制,菌落总数较低(图1),这一定程度解释了混合接种组贮藏11～14d的腐胺含量低于S.putrefaciens组的原因。综上可见,P.putida和S.putrefaciens可以通过代谢共栖等互作效应增强腐败能力,加速冷藏草鱼鱼肉理化指标的劣变。S.putrefaciens的代谢活动(释放可溶性肽等蛋白水解产物和产生腐胺)是两菌互作的重要基础。两菌间互作效应的产生需以S.putrefaciens生长不受抑制为前提。

本研究探究了草鱼腐败微生物P.putida和S.putrefaciens互作对两菌生长和致腐能力的影响。结果表明:P.putida具有较强的分泌嗜铁素的能力,可通过竞争鱼肉中的三价铁离子抑制S.putrefaciens的生长。P.putida和S.putrefaciens一定程度上可以通过代谢共栖等互作效应增强产游离氨和腐胺的能力,加快鱼肉中游离氨和腐胺的生成,但该效应需以S.putrefaciens生长不受抑制为前提。本研究旨在进一步丰富水产品腐败机制相关理论,揭示S.putrefaciens在鱼肉腐败和微生物互作中的基础性作用。后期研究可通过抑制S.putrefaciens的生长破坏鱼肉腐败微生物间的互作效应,从而开发实用高效的鱼肉保鲜新技术。

制作：路旭东

编辑：张逸群、李宁

审核：叶红波