天津科技大学武淑芬讲师等：亚麻籽水溶蛋白与红曲黄色素相互作用及其对色素稳定性的影响

红曲色素属于聚酮类天然食用色素,由红曲霉(Monascus spp.)在大米上发酵而成,主要包括红、橙、黄三类色素^[1]。红曲黄色素作为一类主要的食品着色剂,占市场需求量的60%,其中研究较多的为红曲素(monascin,MS)和安卡红曲黄素(ankaflavin,AK)^[2]。据报道,MS和AK具有降血脂与预防动脉粥样硬化、降血糖、抗氧化、抗炎症、改善阿尔茨海默症等生理功能^[3],在食品、保健、医疗等领域的产品研发中具有较大的应用潜力。然而,MS和AK均属醇溶性色素,水溶性较差,同时对光、热、酸碱敏感,在加工与贮藏过程中易降解,导致其加工稳定性差,生物利用度低^[4],极大地限制了其应用。

利用食品天然组分,如蛋白质、多糖等,构筑复合体系负载食源性活性分子是提高小分子稳定性的良好途径。目前已有相关文献证明^[4],食品营养成分可用于改善红曲色素的物理性质。Wu等^[5]发现,红曲橙色素分子能够进入羟丙基-β-环糊精包合物疏水空腔,从而保持色素的颜色,其光稳性和酸碱稳定性也显著提高;Jian等^[6]以阿拉伯胶为载体制备红曲红色素复合物,发现色素水溶性提高且在酸性条件下能稳定分散。Xu等^[7]考察了淀粉类衍生物对喷雾干燥处理的红曲色素物理性质的影响,发现这些两亲性物质显著改善了色素水溶性。Huang等^[8]以槲皮素-锡(Ⅱ)、牛血清白蛋白和壳聚糖为原料建立的稳定的三元纳米体系包封亲水性红曲黄色素,其光稳定性显著提高,且在不同pH值条件下表现出更好的颜色稳定性。这些研究表明,食品大分子与红曲色素之间的相互作用是维持色素稳态的重要因素。然而,有关红曲黄色素与食品营养成分之间的相互作用机制鲜见报道。

亚麻籽蛋白是亚麻籽加工的脱油副产物,占亚麻籽质量的32%～49%,具有与大豆分离蛋白相媲美的氨基酸组成与含量,含有人体所必需的8种氨基酸,是一种优质的蛋白质资源^[9]。亚麻籽水溶蛋白(water-soluble flaxseed protein,FPW)占亚麻籽蛋白含量的20%～42%,与亚麻籽蛋白相比,其疏水性氨基酸含量较低,在水中溶解性更好。本课题组前期研究发现,未添加FPW的姜黄素在光照2 h后迅速降解,保留率仅约20%,而添加了FPW的姜黄素保留率达到80%,且FPW负载的姜黄素抵抗光照降解效果显著增强^[10]。姜黄素和红曲色素同属于聚酮类化合物,因此,本研究拟以FPW为载体分别制备FPW-MS和FPW-AK复合物,借助荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、红外光谱等分析手段,研究FPW与MS和AK之间的互作行为,进而探究FPW对红曲黄色素稳定性的影响。由于红曲黄色素成本高、分离难度大,通常以混合物的形式应用于食品工业^[4],考虑到实际生产及成本问题,本研究拟以富含红曲黄色素的红曲色素(Monascus pigments,Mps)与FPW制备复合物(FPW-Mps),并对FPW-Mps在水溶液中的分散性与稳定性进行评价,以期为提高红曲黄色素的稳定性提供理论依据,也为红曲黄色素在食品着色和功能性食品领域中的应用提供有益借鉴。

1.1 材料与试剂

去壳亚麻籽,日照孚洽贸易有限公司;AK(纯度≥98%)、MS(纯度≥98%),成都格纯生物医药有限公司;富含MS和AK的Mps^[11],实验室自制;正己烷、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)等,天津市津北精细化工有限公司。实验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1900型紫外-可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;F97Pro型荧光分光光度计,上海棱光技术有限公司;Alpha-2LDplus型真空冷冻干燥机,德国Christ公司;HNY型恒温培养振荡器,天津市欧诺仪器仪表有限公司;Infinite M200 PRO型酶标仪,瑞士Tecan公司;IS50型傅里叶变换红外光谱仪,美国尼高利仪器公司。

1.3 实验方法

1.3.1 FPW的制备

参考马德坤^[10]的方法,提取亚麻籽蛋白。将去壳亚麻籽放入小型榨油机中连续冷榨两次,将榨油后饼粕磨碎成粉,按料液比(g∶mL)为1∶5加入正己烷,室温下搅拌(750 r/min,12 h),更换有机溶剂继续搅拌6 h。将除油后的混合物于通风橱内干燥,获得脱脂亚麻籽粉。以料液比(g∶mL)为1∶15的比例向脱脂亚麻籽粉中加入蒸馏水,用0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值至9.0,室温下磁力搅拌2 h,同时维持pH值恒定,搅拌结束后离心(8 000 r/min,20 min,4 ℃),取上清液。用0.1 mol/L HCl溶液调节pH值至4.4,离心(8 000 r/min,20 min,4 ℃),取沉淀,用蒸馏水复溶并调节pH值至7.0,真空冷冻干燥即得亚麻籽蛋白。取一定量亚麻籽蛋白按料液比(g∶mL)1∶20分散于蒸馏水中,室温下搅拌2 h,离心(10 000 r/min,30 min),收集上清液。重复提取3次,取上清液,真空冷冻干燥即得亚麻籽水溶蛋白。

1.3.2 溶液的配制

1)FPW溶液制备。准确称取500 mg的FPW粉末,溶于10 mL 0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH值为7.4)中,制备成质量浓度为50.0 mg/mL的蛋白母液,混匀,置于4 ℃冰箱过夜水合。

2)MS和AK储备液制备。准确称取0.72 mg MS和0.77 mg AK,分别溶于1 mL DMSO溶液中,制备成浓度为2.0×10^-3 mol/L的MS和AK贮备液,混匀,避光储存、待用。

3)Mps溶液制备。称取100 mg的Mps粉末,加入10 mL无水乙醇,涡旋2 min,超声处理2 min,搅拌至充分溶解,得到质量浓度为10 mg/mL的色素母液,避光储存、待用。

4)FPW-MS、FPW-AK、FPW-Mps混合溶液制备。取一定体积的FPW溶液分别与MS或AK溶液混合,使FPW溶液的终质量浓度固定为0.2 mg/mL,MS的浓度分别为5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μmol/L,AK的浓度分别为10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0 μmol/L。取一定体积的FPW溶液和Mps溶液混合,使FPW溶液的终质量浓度固定为10.0 mg/mL,Mps的质量浓度固定为1.0 mg/mL。将未添加MS或AK的FPW溶液设置为空白对照。所有样品在测试前混合均匀,在室温避光条件下静置30 min。各体系中DMSO体积分数不超过2%,无水乙醇体积分数不超过3%,以消除DMSO和乙醇对蛋白质的诱导变性。

1.3.3 FPW荧光光谱测定

将按照1.3.2方法制备的FPW-MS和FPW-AK溶液,分别在298、304、310 K温度下反应1 h,置于荧光比色杯中测定各样品的荧光发射光谱。设定激发波长为280 nm,扫描波长为300～500 nm,激发和发射狭缝宽度均为10 nm,电压为700 V。室温条件下,分别固定激发和发射波长差值(Δλ=15 nm和Δλ=60 nm)进行样品的同步荧光扫描。以未添加FPW溶液的同等质量浓度的MS或AK溶液为空白背景,以消除MS或AK自身荧光光谱的干扰。

荧光猝灭是指荧光分子与溶剂或溶质分子之间发生反应从而降低荧光强度的现象,主要分为动态猝灭、静态猝灭和联合猝灭3种机制。猝灭机制可依据Stern-Volmer方程进行分析,见式(1)。

=1+K_sv[Q]=1+K_qτ₀[Q]。

(1)

式(1)中:F₀和F分别为未添加和添加MS或AK时FPW的荧光强度;[Q]为MS或AK的浓度,mol/L;K_sv为猝灭常数,L/mol;K_q为双分子猝灭速率常数,L/(mol·s);τ₀为未添加猝灭剂时蛋白质的平均荧光寿命,通常取值为10^-8 s。

对于静态猝灭,结合常数K_a和结合位点数n可依据双对数曲线方程进行计算,见式(2)。

(2)

由Van’t Hoff方程计算MS或AK与FPW结合过程中的热力学参数,进而判断结合力,见式(3)。

ΔG=-RTln K_a=ΔH-TΔS。

(3)

式(3)中,R为理想气体常数8.314 J/(mol·K)。

1.3.4 FPW三维荧光光谱测定

在室温下测定FPW-MS和FPW-AK的三维荧光发射光谱,FPW的质量浓度为0.2 mg/mL,AK或MS的浓度为18.0 μmol/L,设定激发波长为200～360 nm,发射波长为230～600 nm,狭缝宽度为10 nm,电压为700 V,进行三维荧光光谱扫描。以未添加FPW溶液的同等质量浓度的MS或AK溶液为空白背景,以消除MS或AK自身荧光光谱的干扰。

1.3.5 FPW紫外-可见吸收光谱测定

在室温下测定FPW-MS和FPW-AK在波长为200～350 nm处的紫外-可见吸收光谱。根据前期实验,配制质量浓度为0.1 mg/mL的FPW溶液,浓度均为10.0、20.0、30.0、40.0 μmol/L的MS和AK溶液。以未添加FPW溶液的同等质量浓度的MS或AK溶液为空白背景,以消除MS或AK自身紫外光谱的干扰。

1.3.6 FPW二级结构含量测定

对冻干后的FPW、FPW-MS、FPW-AK粉末进行红外光谱分析。红外光谱检测条件:扫描范围400～4 000 cm^-1,分辨率4 cm^-1,扫描32次。选取波数为1 600～1 700 cm^-1的光谱区域,利用PeakFit 4.12软件对谱图进行二阶求导和多重高斯曲线拟合,根据峰面积计算得出FPW二级结构的相对含量。

1.3.7 FPW-Mps在水溶液中的分散性评价

考虑到实际生产及成本问题,选取富含红曲黄色素的Mps进行分散性和稳定性评价。将一定量的Mps分别溶于等体积的蒸馏水和FPW溶液中,磁力搅拌1 h,静置12 h,观察其分散状态。

1.3.8 FPW-Mps光稳定性测定

按照1.3.2方法制备FPW-Mps溶液,改变FPW终质量浓度为5.0、10.0、20.0 mg/mL,充分混匀,分别置于恒温光照培养箱中进行照射(光照强度为 3 900 Lux)12、24、36、48、60、72 h。以相同质量浓度的Mps溶液作为对照,每间隔2 h取样一次,使用紫外-可见分光光度计测定溶液在波长为385 nm(红曲黄色素检测波长)和410 nm(红曲色素检测波长)处的吸光度,依据式(4)计算色素保留率。

色素保留率

(4)

式(4)中,A_n表示光照后吸光度值,A₀表示初始吸光度值。

1.3.9 FPW-Mps热稳定性测定

将按照1.3.2方法制备的FPW-Mps溶液分别置于4 ℃冰箱、25 ℃和50 ℃的水浴锅内,避光孵育10 h。以相同质量浓度的Mps溶液作为对照,每间隔2 h取样一次,测定溶液在波长385 nm和410 nm处的吸光度,依据式(4)计算色素保留率。

1.3.10 FPW-Mps酸碱稳定性测定

按照1.3.2方法制备FPW-Mps溶液,其中FPW溶液分别溶于不同pH值的PBS溶液(0.1 mol/L,pH值分别为3、5、7、9、11)中,充分混匀,在室温下避光孵育10 h。以相同质量浓度的Mps溶液作为对照,测定溶液在波长385 nm和 410 nm 处的吸光度,依据式(4)计算色素保留率。

1.4 数据处理

所有数据均以3次重复测定结果的平均值±标准偏差表示,并采用SPSS 20.0软件进行显著性差异分析,以P<0.05表示差异显著。采用Origin 2022、OMNIC、PeakFit 4.12等软件对实验参数和结果进行分析拟合及图表制作。

2.1 MS或AK与FPW相互作用分析

2.1.1 MS或AK与FPW相互作用对FPW内源荧光的影响

荧光光谱法被广泛应用于研究蛋白质与配体结合后微观结构的变化。蛋白质的内源荧光主要是由色氨酸(tryptophan,Trp)、酪氨酸(tyrosine,Tyr)和苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)所含有的共轭双键或苯环结构产生的。Phe残基的荧光量子产率很低,因此Trp和Tyr残基被认为在蛋白质的内源荧光中发挥了重要作用^[12]。通过考察加入配体前后蛋白内源荧光的改变情况,进而推测蛋白与配体之间的相互作用情况,加入不同浓度MS或AK前后FPW的内源荧光光谱见图1。由图1可知,FPW在波长 331 nm 处存在一个较强的荧光发射峰。加入不同浓度的MS或AK后,FPW的荧光强度逐渐降低,降低程度与MS或AK的浓度呈正相关,说明MS或AK均可以猝灭FPW的内源荧光,且具有浓度依赖性。同时,添加不同浓度的MS使FPW的最大荧光发射波长由331 nm蓝移至329 nm,添加不同浓度的AK使FPW的最大荧光发射波长由331 nm蓝移至327 nm。一般来说,带电基团的运动或荧光基团周围微环境疏水性的增加是导致蛋白荧光强度降低和最大荧光发射波长蓝移的原因^[13]。这些结果表明,MS或AK同FPW的结合导致FPW微观结构发生改变,也就是说,由于FPW与MS或AK的相互作用,以及结合过程中氨基酸残基对溶剂的暴露程度减少,Trp和Tyr残基微环境周围的疏水性增强,最终导致蛋白质分子聚集^[13]。

图1 不同浓度的MS或AK对FPW的内源荧光光谱的影响

Fig.1 Effect of different concentrations of MS or AK on endogenous fluorescence spectra of FPW

当激发波长为280 nm时,蛋白质的内源荧光来自Trp和Tyr,而当激发波长为295 nm时,只有Trp被激发产生荧光^[14]。因此,为确定Trp和Tyr是否都直接参与MS或AK与FPW之间的相互作用过程,分别在激发波长280 nm和295 nm处测定FPW的荧光光谱,并绘制荧光滴定曲线,见图2。由图2可知,随着MS或AK浓度的增加,在两种不同激发波长下FPW的荧光猝灭曲线基本上不存在差异,因此推测与Tyr残基相比,MS或AK与FPW的Trp残基的相互作用更强,使蛋白的荧光发射受到抑制,从而降低了荧光强度。

图2 FPW-MS和FPW-AK的荧光滴定图

Fig.2 Fluorescence titration plots of FPW-MS and FPW-AK

2.1.2 MS或AK与FPW相互作用的荧光猝灭机制分析

一般来说,荧光猝灭分为动态猝灭、静态猝灭,以及联合猝灭等机制。在动态猝灭过程中,荧光物质与猝灭剂发生碰撞,随着温度升高,碰撞加剧,猝灭常数增大;静态猝灭则是荧光物质与猝灭剂之间生成没有荧光或荧光强度较弱的络合物,随着温度升高,复合物的稳定性下降,猝灭常数降低^[15]。因此,可根据不同温度下猝灭数据来确定相关机制。为了确定MS或AK对FPW的荧光猝灭机理,研究了3个不同温度(298、304、310 K)下,MS或AK随着浓度变化时F₀/F的变化,见图3,并用Stern-Volmer方程进行数据分析,见表1。

表1 不同温度下FPW-MS和FPW-AK体系的Stern-Volmer猝灭常数、猝灭速率常数

Tab.1 Stern-Volmer quenching constant and quenching rate constants for FPW-MS and FPW-AK systems at different temperatures

不同小写字母表示同列数据差异显著(P<0.05)。

图3 不同温度下FPW-MS和FPW-AK体系的Stern-Volmer图

Fig.3 Stern-Volmer plots of FPW-MS and FPW-AK systems at different temperatures

由图3和表1可知,MS或AK的浓度与F₀/F有良好的线性关系,直线斜率都随温度的升高而降低,即猝灭常数K_sv减小,符合静态猝灭随温度变化的规律,表明FPW-MS和FPW-AK的猝灭过程均只存在一种猝灭方式,即静态猝灭。此外,有研究表明,猝灭速率常数K_q大于各类猝灭剂对生物大分子最大扩散碰撞猝灭的速率常数[2×10¹⁰ L/(mol·s)]时,复合物的猝灭机制为静态猝灭^[16]。由表1可知,MS或AK对FPW的猝灭速率常数K_q均大于 2×10¹⁰ L/(mol·s),这表明MS或AK对FPW的猝灭机制为静态猝灭,即MS或AK与FPW形成了稳态络合物,导致蛋白内源荧光发生猝灭。值得注意的是,FPW-MS体系的Stern-Volmer图在MS浓度大于15 μmol/L时出现了拐点,这可能是因为随着MS浓度的升高,MS与FPW的结合速率变慢,相互作用强度减弱^[17],在MS浓度大于15 μmol/L时的猝灭常数K_sv减小。

2.1.3 MS或AK与FPW相互作用的结合常数和结合位点数分析

由2.1.2荧光猝灭的研究结果可知,MS或AK的添加使FPW的荧光发生猝灭,猝灭方式为静态猝灭。根据式(2),以lg(F₀/F-1)对lg[Q]绘图,见图4,依据双对数曲线方程进而求得结合常数K_a和结合位点数n,见表2。

表2 不同温度下FPW-MS和FPW-AK体系的结合常数及结合位点数

Tab.2 Binding constants and number of binding sites of FPW-MS and FPW-AK systems at different temperatures

不同小写字母表示同列数据差异显著(P<0.05)。

图4 不同温度下FPW-MS和FPW-AK体系的Lineweaver-Burk双对数

Fig.4 Lineweaver-Burk double logarithm diagram of FPW-MS and FPW-AK systems at different temperatures

结合常数的大小代表着小分子与蛋白质的结合能力。一般小分子与蛋白质的结合常数K_a值位于10⁴～10⁶ L/mol,表示小分子与蛋白质结合力适中^[18]。由表2可知,随着温度的升高,FPW-MS、FPW-AK两个体系的K_a值均呈下降趋势,表明FPW-MS和FPW-AK的形成是放热反应,升温不利于复合物的稳定^[19],这可能是因为活性小分子MS或AK对高温较敏感。与FPW-MS体系相比,FPW-AK体系的K_a值较大,表明FPW-AK间的结合亲和力强于FPW-MS。但这两个体系的K_a值的数量级较低,说明其结合作用力一般。此外,根据曲线的线性度以及相关系数R²>0.96,可推断MS或AK与FPW之间都只存在一个或一类结合位点,这与计算得到n都接近于1的结论一致,表明FPW与MS或AK以1∶1的比例复合^[20]。而MS的结合常数与结合位点数较AK小,可能是MS与AK分子结构不同导致的。MS和AK结构类似,其差异在于烷基侧链的长短,从而导致MS和AK同FPW的互作行为不同,亲和力不同,进而结合量不同^[13]。

2.1.4 MS或AK与FPW相互作用的作用力分析

根据热力学参数表征蛋白质-配体间的非共价力。若ΔH>0、ΔS>0,说明配体与蛋白质之间的作用力主要是疏水作用力;若ΔH<0、ΔS<0,说明配体与蛋白质之间的作用力为范德华力和氢键;若ΔH<0、ΔS>0,说明配体与蛋白质之间的作用力为氢键和静电引力^[21]。依据Van’t Hoff方程计算出结合过程中热力学参数,见表3。由表3可知,对于FPW-MS体系,ΔG<0,表明两者的结合是自发放热过程,ΔH<0、ΔS<0,表明氢键和范德华力是两者结合的主要作用力;而对于FPW-AK体系,ΔG<0、ΔH<0、ΔS>0,表明FPW与AK间的结合也是自发放热反应,维系复合物的主要作用力为氢键和静电作用。然而,由于蛋白质、小分子和溶剂分子在结合过程中发生了各种相互作用和能量交换,它们的贡献很难同时剖析,因此基于热力学分析只能确定主导作用力^[22]。

表3 不同温度下FPW-MS和FPW-AK体系的热力学参数

Tab.3 Thermodynamic parameters of FPW-MS and FPW-AK systems at different temperatures

不同小写字母表示同列数据差异显著(P<0.05)。

2.2 MS或AK对FPW上结合位置微环境的影响

2.2.1 MS或AK与FPW相互作用的同步荧光光谱分析

同步荧光光谱常用于研究蛋白质荧光基团微环境的变化。将激发波长和发射波长的波长差值(Δλ)固定为15 nm和60 nm时,可以分别提供发色基团Tyr和Trp的荧光信息。Tyr和Trp的最大荧光发射波长对环境很敏感,若最大发射波长蓝移,表明氨基酸残基微环境的疏水性增加,红移表明氨基酸残基微环境疏水性降低^[21]。加入不同浓度的MS或AK后,FPW的同步荧光光谱变化见图5。由图5可知,随着MS或AK浓度的增加,FPW的荧光强度不断下降,且Δλ为60 nm时FPW的荧光猝灭程度远强于Δλ为15 nm时,这可能表明Trp残基比Tyr残基对蛋白质荧光的猝灭贡献更大^[23]。当Δλ为15 nm时,FPW的荧光发射峰位置未观察到明显变化;当Δλ为60 nm时,FPW的最大吸收波长发生轻微的蓝移,这表明MS或AK可能诱导FPW的Trp残基微环境向疏水环境转变,且与Tyr残基相比,结合位点可能更靠近Trp残基^[23],这与2.1.1的荧光猝灭结果一致。类似地,Wu等^[24]发现,与MS结合后使得牛血清白蛋白Trp残基和Tyr残基的最大吸收波长均发生轻微蓝移,且Δλ为60 nm时的荧光猝灭程度强于Δλ为15 nm时。这表明Trp残基和Tyr残基周围疏水性增强,并推测MS结合位点可能更靠近Trp残基。

图5 不同浓度的MS或AK对FPW同步荧光光谱的影响

Fig.5 Effect of different concentrations of MS or AK on synchronous fluorescence spectra of FPW

2.2.2 MS或AK与FPW相互作用的三维荧光光谱分析

三维荧光光谱能提供荧光强度随激发波长(λ_ex)和发射波长(λ_em)同时变化时蛋白微观结构的变化情况,可以全面且有效地表征蛋白质在溶液中构象和荧光基团微环境的变化,FPW与MS或AK相互作用后的3D荧光光谱变化见图6。由图6可知,每个三维光谱图中都有3个峰,其中 Peak a(λ_em=λ_ex=360 nm)是瑞利散射峰,荧光强度与大分子直径有关;Peak b (λ_em=2λ_ex)是拉曼散射峰,荧光强度可以反映分子含量信息;Peak 1(λ_ex=280 nm,λ_em=343 nm)是蛋白质的内源荧光特征峰,其荧光强度和最大发射波长与Tyr和Trp残基周围的微环境密切相关^[21]。FPW与MS或AK相互作用后,Peak a强度均有所下降,可能是由于MS或AK的添加使FPW的粒径减小,表明相互作用诱导了FPW多肽链的展开和结构的变化^[25]。此外,MS或AK的加入使FPW的Peak 1强度明显下降,且最大发射峰位置发生了轻微蓝移,均由343 nm蓝移至342 nm处,这表明MS或AK的结合导致FPW中Trp和Tyr残基微环境的疏水性增强,最终导致蛋白构象改变^[14]。

图6 FPW、FPW-MS和FPW-AK体系的三维荧光光谱

Fig.6 3D fluorescence spectra of FPW,FPW-MS and FPW-AK systems

2.3 MS或AK对FPW结构的影响

2.3.1 MS或AK与FPW相互作用的紫外-可见吸收光谱分析

紫外-可见吸收光谱法是研究蛋白质结构变化的一种简便方法,也可用来确定猝灭剂与蛋白之间的猝灭机理。动态猝灭只影响荧光分子的激发态,相互作用后体系的紫外吸收光谱不会发生变化;静态猝灭由于形成复合物,体系的吸收光谱会受到干扰而发生变化^[26]。加入不同浓度MS或AK前后FPW的紫外吸收光谱见图7。由图7可知,FPW具有两个紫外吸收峰,在208 nm附近的强吸收峰主要是由肽链中羰基的n→π^*跃迁引起的,其峰值的变化可以反映FPW中α-螺旋含量的变化,峰值减小则α-螺旋含量降低。还有一个弱吸收峰位于275 nm附近,主要是由Trp和Tyr等氨基酸中芳香杂环π→π^*跃迁引起的^[26]。随着MS或AK浓度的增加,FPW在波长208 nm附近的吸收峰强度逐渐减小,这表明FPW中α-螺旋含量降低;同时FPW的最大吸收波长发生轻微红移,这表明MS或AK与FPW之间发生了相互作用,生成基态复合物,引起FPW肽链的伸展,导致蛋白质骨架结构变得松散^[13]。此外,加入MS或AK后FPW的紫外-可见吸收光谱发生变化,表明MS或AK与FPW的猝灭机理为静态猝灭,这与2.1.2节荧光猝灭机制得到的结果一致。

图7 FPW-MS和FPW-AK体系的紫外吸收光谱

Fig.7 UV-Vis absorption spectra of FPW-MS and FPW-AK systems

2.3.2 MS或AK与FPW相互作用后对FPW二级结构含量的影响

分子中存在多种类型的振动,如化学键的伸缩、扭曲、旋转等,其中一些振动可以引起分子偶极矩发生变化,当这类振动的频率与红外光频率相同时,分子能够吸收红外光能量,形成红外吸收光谱。在红外光谱中,酰胺A带(3 300 cm^-1附近)反映O—H和N—H的拉伸振动,酰胺Ⅰ带(1 600～1 700 cm^-1)反映CO的伸缩振动,酰胺Ⅱ带(1 500～1 600 cm^-1)则反映C—N的伸缩振动和N—H的面内弯曲振动^[27]。加入MS或AK后FPW的红外吸收光谱见图8。由图8可知,MS或AK的加入使FPW的酰胺A带的位置发生了偏移,而酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带处的吸收峰未出现明显的偏移,可以推断出氢键参与了MS和AK与FPW的结合过程,并可能引起了蛋白二级结构的变化^[28]。这与2.1.3结合常数和结合位点数分析结果一致。

图8 FPW、FPW-MS和FPW-AK体系的红外光谱

Fig.8 Infrared spectra of FPW,FPW-MS and FPW-AK systems

酰胺Ⅰ带的振动谱带反映了蛋白质的二级结构信息。对α-螺旋(1 650～1 660 cm^-1)、β-折叠(1 600～1 640 cm^-1)、β-转角(1 660～1 700 cm^-1)和无规则卷曲(1 640～1 650 cm^-1)进行了定量分析^[10],结果见表4。由表4可知,β-转角是FPW的主要二级结构,MS或AK的添加使FPW的α-螺旋和β-转角相对含量降低,β-折叠和无规则卷曲相对含量提高,这表明MS或AK与FPW发生了相互作用,引起FPW构象发生改变。α-螺旋结构的稳定性主要是靠多肽链内氢键维持的^[28],这表明MS或AK的添加,破坏了蛋白多肽链上羰基与氨基之间的氢键作用。FPW二级结构由α-螺旋和β-转角向β-折叠和无规则卷曲转变,使得蛋白质多肽链部分解折叠,最后导致蛋白质的结构更加松散^[29]。

表4 FPW的二级结构相对含量变化

Tab.4 Relative content changes of secondary structures of FPW %

2.4 红曲色素分散性及稳定性分析

2.4.1 红曲色素分散性分析

天然红曲色素营养丰富,并具有多种生理功效及低生物毒性等特点,被广泛应用于食品及保健品中。考虑到实际成本及应用问题,本研究选用富含红曲黄色素的红曲色素Mps来考察其在水中和FPW溶液中的分散性和稳定性。

在避光条件下,研究了红曲色素(Mps)分别溶于蒸馏水和FPW水溶液(2.0 mg/mL)的分散状态,实验结果如图9。由图9可见,磁力搅拌1 h后,Mps在水中不能完全分散,有肉眼可见的颗粒悬浮于水中,而在FPW水溶液中Mps能均匀分散,没有肉眼可见的不溶物。静置12 h后,Mps在蒸馏水和FPW水溶液中都有沉淀,蒸馏水中的沉淀更多且明显,而FPW水溶液中沉淀极少,这表明FPW水溶液提高了Mps在水中的分散性。

图9 Mps在蒸馏水和FPW溶液中的分散性

Fig.9 Dispersion of Mps in distilled water and FPW solution

2.4.2 红曲色素光稳定性分析

当色素溶液受光照射后,其脂肪族侧链先在 α-碳原子处发生Norrish Ⅰ型分解,与苯环断开,羰基分子电子重新排布,形成羟基和双键,其他位置的双键也发生分子重排。同时,在光的照射下水溶液产生大量羟自由基、超氧阴离子等,与色素结构中双键发生加成反应,使共轭双键消失,导致红曲色素颜色消失^[30]。为考察Mps溶液和FPW-Mps在光照72 h内的色素保留率,分别于385 nm(红曲黄色素检测波长)和410 nm(红曲色素检测波长)处测得吸光度,见图10。由图10可知,随着FPW质量浓度的增大,Mps保留率也随之增大,与游离的Mps相比,Mps的保留率分别提高了9.53%、16.92%、31.37%,表明FPW-Mps能提高Mps的光稳定性。可能的原因是FPW与Mps发生相互作用形成了复合物,从而对Mps起到保护作用^[31]。值得注意的是,Mps或FPW-Mps在最初接受光照射时,保留率降低幅度较大,随后保留率下降趋缓,这可能是因为游离的Mps浓度较大,接受的光量子较多,色素分子中的发色团及共轭体系很容易受到破坏,因而光降解速率快。而之后保留率变化变缓,可能是因为Mps与FPW发生了相互作用,使色素在水溶液中更稳定,也可能是Mps在光降解开始时生成大量的自由基,自由基之间发生耦合反应,不利于小分子产物的生成与释放,从而降低了光量子产率;同时降解过程中伴随着短链和双键产生,双键的形成有可能被自由基引发而生成交联产物,使后期Mps保留率下降缓慢^[32]。

FPW后括号内数字为FPW质量浓度,mg/mL。

图10 不同光照条件下Mps和FPW-Mps的色素保留率

Fig.10 Pigment retention rates of Mps and FPW-Mps under different illumination conditions

2.4.3 红曲色素热稳定性分析

红曲色素的稳定性易受到储存环境的影响,从而影响产品的货架期。通常红曲色素应用食品在储存、运输过程中均采用避光容器,但其色泽仍不稳定。因此,结合应用红曲色素的食品在实际生产流通过程中的情况,在避光条件下,探究了环境温度对色素及其复合物的稳定性产生的影响,实验结果见图11。

Mps和FPW后括号内数字均为温度,℃。

图11 不同温度条件下Mps和FPW-Mps的色素保留率

Fig.11 Pigment retention rates of Mps and FPW-Mps at different temperatures

由图11可知,在不同温度条件下,FPW-Mps的保留率均显著高于游离Mps,且复合物中色素含量的下降速率明显低于Mps,这表明FPW可以有效地减缓Mps的降解,提高其热稳定性。对于游离Mps,色素降解的程度随着温度的升高而增大,在3个温度条件下均发生快速降解;而与FPW复合后,Mps的保留率分别提高了25.65%、22.04%、25.98%。这可能是因为经过热处理后,蛋白质的结构进一步展开,内部的疏水区域暴露出来,导致蛋白质聚集,并在蛋白质颗粒中产生新的分子间或分子内作用力,从而将小分子包裹和保护起来。Iftikhar等^[33]发现,添加了酪蛋白酸钠的红曲色素在100 ℃条件下色素的降解率降低,加热120 min后的吸光度比未添加酪蛋白酸钠的色素吸光度提高了0.32,其原因可能是酪蛋白酸钠和红曲色素之间通过疏水相互作用和氢键等形成复合物,从而实现了对色素的保护。

2.4.4 红曲色素酸碱稳定性分析

大多数食品为弱酸性(pH值为4～6),部分水果、果汁饮料等为高酸食品,pH值可以达到2左右,而部分蔬菜和水果、豆类等为弱碱性,pH值可以达到7以上。许多天然色素对酸碱变化敏感,酸碱变化时其色调和稳定性会随之发生变化,因此,在避光条件下,探究了酸碱对色素及其复合物稳定性产生的影响,实验结果见图12。由图12可知,红曲色素对酸碱的耐受性较光和热好,在不同pH值条件下,色素保留率均在70%以上。同时,在所测pH值范围内,FPW-Mps的保留率均显著高于游离Mps,分别提高了10.27%、12.96%、12.06%、17.82%、7.27%。这表明,FPW-Mps能有效降低Mps的降解率,提高其酸碱稳定性,原因可能是,在pH值为 3～11时,红曲色素的结构随pH值的改变程度较小,色泽稳定;也可能是形成复合物后,红曲色素进入FPW的疏水空腔后被包裹起来,因而pH值的改变对红曲色素分子结构的影响更小,色泽稳定^[34]。

图12 不同pH值条件下Mps和FPW-Mps的色素保留率

Fig.12 Pigment retention retes of Mps and FPW-Mps at different pH values

本研究借助多重光谱等技术研究FPW与MS、AK之间的互作行为,并对FPW-Mps在水溶液中的分散性与稳定性进行了评价。研究结果表明,两种红曲黄色素MS和AK均能导致FPW荧光猝灭,两个体系的猝灭方式均为静态猝灭,表明MS、AK与FPW之间形成了复合物,且AK对FPW的结合亲和力强于MS。MS、AK与FPW结合的主要作用力不同,分别为氢键、范德华力和氢键、静电作用。结合位点数n表明MS、AK与FPW均存在一个或一类结合位点,从而形成稳定的、比例为1∶1的复合物。MS或AK均能够诱导FPW二级结构部分展开,促使部分α-螺旋转变为β-折叠,使FPW多肽链解折叠,并提高了FPW中Trp残基微环境的疏水性,表明MS或AK的结合导致蛋白构象改变。同时,FPW与富含红曲黄色素的Mps结合后,其在水中分散性及光稳定性、热稳定性、pH稳定性均比游离Mps有显著提高。本研究旨在为FPW与MS、AK的相互作用研究提供一定的理论指导,并为红曲色素在食品着色及功能性食品中的应用提供技术支撑。

制作：路旭东

编辑：张逸群、李宁

审核：叶红波