缘起：
客户咨询ELISA试剂盒，其中有一个指标是小分子化合物，经过查询居然有夹心法。常识中，免疫分析测小分子都采用竞争法，原因是小分子化合物与对应抗体的结合位点多为穴状结构，导致小分子的大部分结构被包埋，难以被另外一个抗体结合导致无法使用夹心免疫分析法进行检测，那为什么ELISA试剂盒中又出现夹心法测小分子呢？要弄明白这个问题，首先要从免疫分析中的竞争法和非竞争法说起。免疫分析法
1960年，美国科学家Rosalyn Yalow（1921～2011）和 Solomon A. Berson（1918～1972）在研究糖尿病时，第一次使用I-125 标记胰岛素测量糖尿病患者尿液中的胰岛素水平，解决了之前难以测定的微量生物活性物质的临床检测问题（Yalow R S, Berson S A. Immunoassay of endogenous plasmainsulin in man[J]. Clin Invest, 1960, 39(1): 1157-1175）。从此，开起了免疫分析的序幕。免疫检测原理：利用抗原和抗体的特异性反应进行检测，采用同位素、酶、化学发光物质等作为标记检测信号，从而实现对抗原或抗体的定量或定性分析。常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。免疫诊断在临床诊断中占据着非常重要的地位，常见的免疫技术有放射性免疫、酶联免疫、化学发光、电化学发光、磁微粒化学发光。免疫分析一般分为竞争性方法和非竞争性方法，主要区别在于它们与抗原和抗体的结合方式不同。竞争性方法主要利用标记待测物和待测物，与特异性抗体之间的竞争性结合原理。在这种方法中，标记抗原与未知抗原（待测样品中的抗原）同时存在时，会与固定量的抗体进行竞争结合。当未知抗原的量增加时，标记抗原与抗体结合的量就会减少，这种减少的量与未知抗原的量之间存在一定的函数关系。通过测量这种减少的量，可以计算出未知样品中抗原的浓度。这种方法要求有高纯度的标记抗原，并且需要寻找合适的标准品来绘制剂量反应标准曲线，以便通过标准曲线求出被测样品的浓度。小分子化合物的单克隆抗体的亲和常数在一般情况下很难超过10∧12 mol/L,这就决定了竞争性分析模式难以达到亚飞摩尔浓度的测量水平。另外,在低浓度的反应信号很难与背景信号区别开来，存在待测物低浓度的相对误差较大，分析过程的重现性差,反应孵育时间过长,所有上述因素致使竞争性免疫分析在灵敏度、精密度、动力学及工作曲线范围方面都不及非竞争免疫分析。![]()
非竞争性方法（如夹心免疫法）则涉及使用一个捕捉抗体和一个检测抗原的抗体。这种方法要求抗原分子足够大，以包含两个抗原表位，每个抗体都能充分无阻地结合抗原，从而实现对样品分析物进行检测和定量。非竞争性方法通常用于测量大分子抗原或抗体，它们需要一个捕捉抗体将抗原固定在载体表面，然后加入一个酶标记的特异性检测抗体进行检测，产生可测量的信号。这种检测模式不适用于小分子化合物，血管紧张素Ⅱ是迄今为止采用双位点夹心法能够测量到的最小分子(相对分子质量1048)。这两种方法各有特点，竞争性方法适用于小分子物质的测量，因为半抗原的空间结构特点决定了它不能同时与两株抗体结合，如药物、激素和毒素等，其中需要使用一个标记的抗原进行竞争；而非竞争性方法则更适合于大分子物质的测量，如蛋白质和病毒等，它通过夹心式的方式检测和分析物。这两种方法在免疫分析中都有广泛的应用，选择哪种方法取决于待测物质的性质和分析的具体需求![]()
小分子化合物简介
小分子化合物(相对分子质量通常小于1000)，如抗生素，化学药物、小分子腺激素、小分子肽、维生素和多糖等，这类化合物在免疫反应中只具有反应原性，而没有免疫原性，通常在免疫化学上被定义为半抗原。很难产生免疫应答，只有通过与大分子蛋白或者载体蛋白结合，形成“完全抗原”，才能具有免疫原性，产生特异性识别小分子抗原的抗体。由于分子体积和空间位阻的原因，小分子化合物通常只有一个抗原表位，免疫测定一般采用竞争性分析模式。临床应用方面常见的小分子有很多，如T3、T4、雌二醇、孕酮、醛固酮、25羟基维生素D、他克莫司、环孢霉素等。基于生物素-亲和素体系的非竞争性免疫分析方法
1990年Ishikawa等(E Ishikawa, K Tanaka, S Hashida. Novel and sensitive noncompetitive (two-site) immunoassay for haptens with emphasis on peptides[J]. Clinical Biochemistry, 1990, 23(5): 445-453.)提出了基于生物素亲和素体系检测小分子肽的双位点夹心免疫分析模式。由于小分子肽只有单一抗原表位，传统的夹心法无法检测。研究者设计依赖于使用强亲和系统，即生物素-亲和素复合物。生物素与分析物共价偶联获得两个抗原位点进而可以采用夹心免疫检测。检测原理是生物素化后的待测物可同时结合半抗原抗体和固相的亲和素，从而可建立针对半抗原的双位点夹心式的非竞争性分析方法。反应过程大致如下：1、在待测物分子上标记上生物素，从而生成一个体积更大的生物素化待检物的复合物，该复合物产生第二个表位（生物素抗原表位）；2、生物素化的待测物经固相抗体纯化后，再与标记抗体混合；3、转移到预包被有亲和素的固相载体上，进行夹心非竞争性反应；4、最后，记录信号强度，信号强度与样品中待测抗原的含量成正相关。这种分析方法已经成功应用到具有伯氨基的血管紧张素Ⅱ、精氨酸加压素等小肽以及甲状腺素的测定。然而，生物素化反应和亲和纯化过程复杂且耗时，限制了这种方法的应用。此外，确保检测的准确性需要对样本进行适当的预处理（全血，血清或血浆），并尽量减少对样本的过多干扰，才能确保对样本的溯源。这种方法对样本进行生物化标记处理，还需要经过亲和纯化过程，对样本产生诸多干扰，作为一种探索方法算是创新了，但是无法适应现代检测高效，快速，准确的理念，导致无法在临床检验中有效推广和应用。基于抗独特型抗体的非竞争性免疫分析方法
抗独特型抗体(Anti-idiotype Antibody，Ab2)是针对抗体( Ab1)可变区的抗原决定簇，即抗体的独特位所产生的特异性抗体。独特型的差异由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)内氨基酸序列不同造成。抗独特型抗体有Ab2α和Ab2β两种。Ab2α识别抗体可变区骨架区内的独特型决定簇，是抗体中远离抗原结合部位的抗原决定簇产生的抗体，不影响Ab1与抗原的结合，属半抗原非抑制性Ab2。Ab2β由抗体的抗原结合部位处的抗原决定簇产生的抗体,可完全抑制抗原与Ab1的结合，有效阻断Ab1对抗原的识别，被认为是抗原的“内影像”。1990年Bamard 等( Barnard G， Kohen F. Idiometric assay : noncompetitive immunoassay for small molecules typified by the measurement of estradiol in serum. Clinical Chemistry, 1990, 36(11): 1945-1950)报道建立了一种基于抗独特型抗体检测小分子化合物的非竞争性免疫分析方法，并用于血清中雌二醇的测定。反应过程大致如下：
2、加入Ab2β，封闭Ab1中未被待测物占用的结合位点;3、加入标记的Ab2α，由于空间位阻，Ab2α不能和Ab2B/Ab1复合物结合，而是识别捕获有待测物的那部分抗体的骨架区位点；4、最终读出的信号强度与抗体结合的待测物分子数量，也就是样品中待测物的含量成正相关。这种方法先后成功应用于雌二醇、皮质醇、甲氧基有机磷农药、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的测定。但是抗独特型抗体的制备有一定难度，阳性克隆率低，抗体分型筛选复杂，获得配对效果较好的Ab2α和Ab2β困难，限制了此方法的开发和应用。基于固相固定化表位体系的非竞争性免疫分析方法
1994年Pradelles等（Pradelles P, Grassi J, Creminon C, et al. Immunometric assay of low molecular weight haptens containing primary amino groups. Analytical Chemistry, 1994, 66(1):16-22）报道了基于固相固定化表位体系的非竞争性免疫分析方法(Solid -phaseImmobilized Epitope Immunoassay , SPIE-IA)用于检测小分子半抗原。这种方法基于捕获抗体和检测抗体相继识别的单个表位，涉及分析物与固相的共价交联。反应过程大致如下：1、用固定化抗体捕获半抗原分析物(标准物或样品)；2、半抗原分子的氨基基团通过双功能试剂（戊二醛、双琥珀酰亚胺辛二酸酯等）与固相抗体发生化学共价偶联；3、生物偶联后，在酸、碱或有机溶剂的变性作用处理下，半抗原表位由抗体结合位点处释放；4、借助共价健偶联在固相载体上的半抗原，被释放的抗原表位可以被酶标抗体重新识别。通过酶活性监测结果。这种方法的优点在于固相抗体和检测抗体可以是同一种抗体，省去了传统的双抗体夹心法需要筛选针对不同抗原决定簇的两种抗体的复杂程序；而局限性则在于要求目标分析物含有氨基官能团。该方法已被发展到甲状腺素、白三烯C43等的测定。当然，对于很多不含有氨基的半抗原分子，如促甲状腺激素释放激素(TRH)，可通过化学修饰引入氨基基团,再进行SPIE-IA反应。也可以通过紫外辐照或类Fenton试剂产生的羟基自由基触发的方式实现半抗原与固相抗体的直接交联。但是，紫外线照射一定程度上也会降解免疫复合物，限制了该方法的广泛应用。同样，这种方法涉及对待检物共价偶联，并用变性的方法释放待检物，对样本产生诸多干扰，作为一种探索方法算是创新了，但是无法适应现代检测高效，快速，准确的理念，导致无法在临床检验中有效推广和应用。Open sandwich开放式非竞争性免疫分析方法
1996年Ueda等 (Ueda H, Tsumoto K, Kubota K, Suzuki E, Nagamune T, Nishimura H, et al. Open sandwich ELISA: a novel immunoassay based on the interchain interaction of antibody variable region[J]. Nature Biotechnology, 1996, 14(13): 1714-1718.)首次报道了在抗原存在时，抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)的结合稳定性得到增强这一现象，并提出了开放式夹心免疫分析法(Open Sandwich Immunoassay , OS-IA)的概念，该方法的优点在于其适用性与靶标分析物的分子量无关。其原理是游离VL和VH相互作用非常弱，在低浓度下趋于解离状态，但是在相应抗原存在时，VL与VH会通过抗原“桥梁”作用提高相互结合的亲和力和稳定性。目前，该方法已成功应用于玉米赤霉烯酮、赤霉醇、双酚A、骨钙素、类固醇、雌激素、甲状腺素T4以及膝沟藻毒素的检测。然而，这种方法由于抗体的制备与筛选、编码VH与VL的 DNA片段的构建以及融合蛋白的表达与纯化等过程较为复杂，而且并非所有的抗体VH/VL间的相互作用都与抗原有关，需要选择合适的抗体来建立OS-IA体系，在推广应用上仍存在一定的难度。基于酶标记分析物/分析物抗体位点置换反应的非竞争性免疫分析方法
1999年Giraudi等（Giraudi G, Anfossi L, Rosso I, et al. A general method to perform a noncompetitive immunoassay for small molecules. Analytical Chemistry, 1999, 71(20 ) : 4697-4700）提出了基于酶标记分析物-分析物抗体位点置换反应来检测半抗原的非竞争性免疫分析方法，该方法原理是在封闭剂存在下，基于抗体与酶标记分析物和分析物结合亲和力的差异，酶标记分析物竞争置换分析物进而检测分析物，该方法的关键在于有效封闭。其反应过程大致如下:4、最后，标记后的分析物信号强度与分析物浓度呈正相关。基于抗免疫复合物抗体的非竞争性免疫分析方法
抗免疫复合物抗体是针对抗原与抗体结合后形成的新的抗原表位所产生的特异性抗体，又叫抗异型抗体(Anti-metatype Antibody)。该抗体只能识别抗原抗体复合物，对单独存在的抗原或抗体几乎没有作用。1994年Self等（Self C H, Dessi J L, Winger L A. High-performance assays of small molecules：enhanced sensitivity, rapidity,and convenience demonstrated with a noncompetitive immunometric anti-immune complex assay system for digoxin. Clinical Chemistry, 1994, 40(11): 2035-2041.）建立了基于抗免疫复合物抗体检测地高辛的非竞争性免疫分析方法。此方法的优点是不需要对样本进行化学处理和纯化，完全符合现代检测高效，快速，准确的理念。这种方法的缺点是：抗免疫复合物抗体很难获得，主要原因在于抗体结合抗原后引起的免疫复合物的空间构象变化细微，且半抗原高达85%的可及表面包埋于抗体内部，难以形成新的有效的抗原决定簇。并且在筛选过程中,由于抗免疫复合物抗体与Ab1以及分析物组成的三元复合物相互间的接触表面积较大,无法实现对免疫复合物空间构象变化的精准识别，从而造成较高的非特异性干扰。基于噬菌体展示技术(Phage-displayed Library )则较好地解决了这一问题，研究者发现噬菌体展示短肽能够识别抗原抗体复合物从而发展出了噬菌体抗免疫复合物分析法(phage anti-immune complex assay, PHAIA)，在小分子化合物的非竞争性免疫分析领域有很好的应用前景。基于抗免疫复合物抗体的非竞争性免疫分析方法从本质上规避了竞争法带来的固有缺陷，多家国产IVD公司投入大量时间和成本研发，并实现了突破，大量数据结果表明显示小分子夹心法与LC-MS/MS方法高度一致，同时灵敏度和特异性也有了质的飞跃，可以进一步拓展和深化临床应用研究，同时也可以为小分子检测项目的标准化提供更多科学证据。此方法将逐渐发展成检测小分子化学化合物夹心法的主流技术。
写在最后
随着小分子化合物夹心法检测研究的深入，逐渐发展出来基于抗体-适配体的夹心法，基于适配体-适配体的夹心法。相比抗体和抗体的夹心模式，通过使用适配体和抗体的夹心组合可以有效降低空间位阻效应，实现针对小分子的夹心检测。此外，筛选合适的适配体是成功建立适配体-分析物-抗体夹心检测的关键。技术的迭代和创新是推动社会进步和发展的重要动力，而这一过程往往是由市场需求和技术本身的进步共同驱动的。创新技术和产品的开发最终都需要落地于临床和检验，高质量服务于临床和检验，小分子夹心法免疫分析技术的突破带来了产品性能多维度的提升，从本质上规避了竞争法带来的方法学的缺陷，如精密度欠缺、准确度不够、易受干扰、线性范围窄等，其临床应用存在较多的局限性和争议。LC-MS/MS作为小分子检测的金标准，具有优异的特异性和准确度，然而，其通量低、前处理复杂、对设备和人员要求高等缺点限制了其广泛使用。在未来，开发一种兼顾免疫学方法和LC-MS/MS方法两者优势的检测技术来检测小分子化合物成为检验技术和检验行业的使命之一，需要所有检验人携手共进，共同努力，实现现代检验高效，快速，准确的理念。
