荧光定量PCR技术

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1．TaqMan技术

TaqMan技术是PE公司开发的一种基于PCR技术为基础的荧光定量技术。它利用了Taq酶的5’－3’外切酶活性，合成一对能与PCR产物杂交的探针，探针的5’端标记一个荧光报告基团R（reporter），3’标记另一个荧光淬灭基团Q（quencher）。其中3’端荧光基团Q通过能量共振能够吸收5’端荧光基团R发出的荧光，因此正常情况下该探针检测不到的5’端R基团发出的荧光，只能检测到3’端Q基团的荧光信号，但当溶液中有PCR产物（模板）时，该探针与模板结合，激活Taq酶的5’外切酶活性，将探针5’端连接的R基团从探针上切割下来，从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。如图1所示。TaqMan技术来所面临的一个最大的问题是探针的线性结构导致了较高的背景荧光。如果荧光基团和淬灭基团的距离太近，那么在PCR扩增过程中，探针在它们之间降解的可能性将大为降低，从而起不到探针的作用；相反，如果把荧光基团和淬灭基团分别放在探针的两端，则又会使背景信号大大提高，影响其检测灵敏度。另外还有一些不足，如：（1）采用酶外切活性，因此定量时受酶的性能影响；（2）探针标记成本较高，不便用于少量样本的检测；（3）在实验过程中必须使用配套的实验器材，操作上会有一定的麻烦。

2.分子信标(molecular beacon,MB)

分子信标技术是Stratagene公司开发的一种PCR定量技术，其反应原理是1996年Tyagi等提出的“分子信标”概念。也有人译为“分子灯塔”。MB是一种茎环状部分与靶序列互补，位于主干部分的5’和3’端分别标记报告荧光基团R和淬灭荧光基团Q。正常时，发夹呈环状关闭状态，报告荧光和淬灭荧光相距很近，报告荧光淬灭。PCR扩增时探针与模板杂交，发夹展开，报告荧光和淬灭荧光拉开，从而释放荧光，即在退火时可测定荧光，而在PCR的延伸阶段，探针有从模板上解离，重新形成茎环结构，荧光消失。如图2所示。荧光强度与扩增产物呈正比，随着每次循环扩增产物的增加，其荧光强度也增加，它可反映每次扩增末期产物积累的量。该方法的特点是采用非荧光染料作为淬灭基团，因此荧光合成时标记较复杂。分子信标技术结合不同荧光标记可用于基因多突变位点同时分析。MB虽然有效地解决了淬灭效率问题，但是由于其荧光信号仅仅是依靠与靶基因杂交时所引起的构象变化产生的，在PCR/MB检测过程中，MB必须与PCR产物的一条链竞争结合在另一条链的靶基因位点上，只有在竞争的过程中获胜的MB探针才能产生荧光，这就极大的影响了MB的检测结果。

目前，引物的改良已使MB技术得以改进，如发卡式引物（Sunrise primer）、蝎状引物（scorpion primer）。发卡式引物的特点是所有的扩增产物均能标记上荧光基团，因此荧光信号响应快，但无法区分特异和非特异性扩增是其致命的不足。蝎状引物技术在引物与MB探针之间连接一个间隔臂，使PCR延伸反应时不能够延伸至MB分子，这样非特异性扩增产物便无荧光信号，但当有特异扩增产物时MB即可与扩增产物进行分子内杂交，产生荧光信号。此方法既解决了非特异问题，又保留了其响应快的特点，但是仍存在杂交时探针不能完全与模板匹配及合成复杂的问题。

图2. 分子信标MB

3.Amplisensor(Biotronics)

Amplisensor是一种复合探针技术，一个探针上连接一种荧光物，另一探针连接一淬灭物。两探针长度不同，其中一种探针5’端多出7个碱基（GCGTCCC）。PCR扩增前需将此探针与PCR引物连接，PCR引物的5’末端应有一端与长探针互补的序列，以便连接酶将引物与探针连接。扩增时该探针－引物复合物中的代引物部分作为半套式引物掺入到模板，从而释放出淬灭探针部分，破坏了FRET，而产生荧光。荧光的强度与扩增时加入的模板数成正比。该方法的主要特点；（1）由于采用了半套式PCR扩增可提高灵敏度，但无法区分因引物二聚体形成产生的非特异扩增信号，这样定量准确度受影响；（2）每次PCR反应前，要先进行Amplisensor的标记，增加了操作步骤和检测成本；（3）中间需要加入半套式引物，增加污染机会。

4.LightCycler

LightCycler是Roche Diagnostics开发的一种PCR定量技术，分别设计了两个探针，一个带有3’端单标记荧光供体D（donor）另一个5’端单标记荧光受体A（accepter）。退火时两探针均与同一条模板相结合，它们之间形成荧光共振能量传递。发光二极管激发3’单标记荧光供体，经荧光共振能量传递给5’单标记荧光受体探针产生实时荧光而被检测。如图3所示。该方法的特点是淬灭效率高，但由于两种探针结合于模板上会影响扩增效率。此外，由于需要合成较长的探针，成本较高。

图3. 用于定量的LightCycler

5.TaqMan MGB(minor groove binder)探针

美国应用生物系统（Applied Biosystems,ABI）公司最新推出了一种TaqMan MGB荧光探针。与常规TaqMan荧光探针相比，一是这种探针3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，以取代常规可发光的TAMRA荧光标记，这一新技术使荧光本底降低，荧光光谱分辨率得以改善。二是探针3’端另结合Minor groove binder结合物，使的探针的Tm值提高，增加了探针的杂交稳定性。用TaqMan MGB荧光探针检测SNP，其探针长度在13－18个碱基之间，而常规TaqMan长度较多时可达30－40个碱基，探针长度越长，其SNP识别率越低。新型TaqMan-MGB探针使荧光定量PCR技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变，有望成为基因诊断和个体化用药的一个技术平台。

6.TaqMan－MB复合探针法

TaqMan及MB是较为常用的两类探针，并在许多方面都显示了广阔的应用前景。但是它们各自都有缺陷和不足。TaqMan－MB复合探针法解决了TaqMan及MB的一些问题。该探针保留了MB的茎环结构，这一结果保证了荧光基团和淬灭基团紧密接触，从而有效地解决了背景荧光的问题。但与常规地MB不同的是除环部序列外，5’端的臂序列也设计为探针的基因识别部位。在PCR扩增的退火/延伸阶段，探针与模板上相应的靶基因位点特异性结合。同时，Taq酶随着引物的延伸沿DNA模板移动，当移到探针结合位置时，发挥其5’－3’外切酶活性，将探针切断，从而使荧光基团与淬灭基团彻底远离，荧光基团荧光复原。如图4所示。体外荧光信号的产生来自于两方面的贡献：（1）来自于探针与靶基因杂交时所引起的构相变化，（2）来自于探针的降解，这就增强了体系的荧光强度。荧光强度与溶液中模板数量成正比，因此，可进行PCR定量。复合探针法使用非荧光淬灭剂，成本较低，对扩增效率影响小，探针的操作方便（如设计﹑合成﹑标记﹑纯化等）。

图4。TaqMan－MB复合探针

7.SYBR Green I染料

在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I荧光染料，SYBR Green I荧光染料可有规律的每隔13－14个碱基特异性地嵌入DNA双链后，嵌入后发射荧光信号是自身荧光的200倍，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR Green I 染料不需要特异性探针，其特异性完全由引物决定。在有非特异双链DNA产生时，其荧光也同样增强，此法与常规PCR的特异性差距不大。SYBR Green I与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格低廉。SYBR Green I 染料很容易检出所有扩增产物，但若发生非特异性扩增或者发生非引物二聚体，也会干扰正确结果。