细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。
一、关于融合剂
细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG），在分子 量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50％，pH 8. 0～pH 8. 2（用10％ NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。50％浓度，pH偏碱时融合效应最高。也有采用30%～50％浓度的PEG加上10％二甲亚砜。不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。
二、融合步骤
1. NS-1细胞的准备：融合一次需要2-3瓶细胞（100 mL）。轻摇使细胞转移至50 mL离心管，于700 rpm，离心7 min。弃上清，用单纯1640约40 mL重悬，700 rpm，再离心7 min。（NS-1洗涤离心2次）
2. 脾淋巴细胞的准备：取72 h前免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5-7分钟，在超净台中用无菌手术剪剪开腹部皮肤，看到脾脏，换眼科剪镊，剪开腹膜，取出脾脏，将脾周边剪5-6下，放入100 mL烧杯中，加单纯1640约4小巴氏，然后用大镊子边搅动边夹脾脏，待脾至透明薄膜状，将脾包膜取出。
3. 将上层脾细胞转至50 mL圆底离心管，待剩余少部分时，补加1小巴氏单纯1640重悬，吸上清至50 mL圆底离心管。
4. 取离心后的NS-1细胞，用单纯1640（3-4小巴氏）重悬，与脾细胞混合，补加单纯1640至40 mL左右，1000 rpm，离心10 min。
5. 取PEG（0.6 g于青瓶灭菌）在酒精灯上烧至融化，加0.6 mL单纯1640，混匀。
6. 取离心后的50 mL离心管，弃上清，在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，置40℃水浴中预热。
7. 用1 mL吸管在2分钟内缓慢滴加50% PEG 1 mL，边滴加边轻轻摇动。 然后用1 mL吸管在1分钟内滴加1 mL单纯1640，边滴加边轻轻摇动，重复加入1 mL单纯1640 1次。然后在30秒内滴加1 mL单纯1640，重复滴加1次；最后补加单纯1640约至40 mL，于500 rpm，离心6 min。依次加入，详见下表：
8. 取96孔板，每孔加入2滴含HAT的完全1640培养液，每次融合4板，同时做NS-1对照孔（1竖列）。
9. 取离心后的融合管，弃上清，于手掌轻敲几下，加入HAT完全1640约4小巴氏管，轻轻吹打几下，再补加至30 mL左右（根据96孔板数），反复轻吹打几下，每孔1滴加入已含有HAT完全1640的96孔板中。
10. 用皮套将96孔板勒紧，放置37℃、6.5% CO2培养。于第四天镜下观察融合情况，进行换液，于第七天进行单抗初筛，后续采用5% CO2培养。
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