1，毕赤酵母表达系统的构成：
载体：毕赤酵母一般采用整合型穿梭质粒作为外源基因的表达载体。表达载体的遗传操作在大肠杆菌中进行（如载体保存、扩增和构建等），通过载体线性化电转酵母感受态细胞后，载体整合进酵母染色体中，表达外源蛋白。根据外源蛋白能否分泌表达将载体分为胞内表达载体（如pPIC3、pPSC3k、pAO815和pPICZA等）和胞外分泌型表达载体（如pPIC9、pPIC9K、pGAPZa、pHIL-S1p和YAM7SP6等）。
毕赤酵母的高密度发酵一般分两个阶段进行，首先在碳源为甘油或葡萄糖的培养基中进行的生长阶段，积累足够的细胞密度和生物量，然后再将碳源切换至甲醇进行诱导表达目标蛋白的发酵阶段。这种方式可以提高外源蛋白的表达水平，并且使得毕赤酵母在较短时间内积累高浓度的目标蛋白。
培养基成分对发酵影响：在高密度发酵中，培养基的成分会直接影响毕赤酵母细胞的生长以及外源基因的表达，同时也会影响工程菌的遗传稳定性。因此，毕赤酵母高密度发酵通常会针对不同的研究目的和外源蛋白特性，在选择或设计培养基时进行优化，以达到最佳的发酵效果。通常在进行毕赤酵母高密度发酵时，由于一些分泌型外源蛋白对蛋白酶的敏感度较高，容易被降解。针对这种情况，通常在毕赤酵母高密度发酵时，会选择添加含有蛋白胨和酵母粉的培养基，或者添加1%酪蛋白水解物以防止或降低外源蛋白的降解。
高水平的甲醇（浓度高于5%）对细胞活力毒性很大，可导致代谢中间产物甲醛和过氧化氢的积累，从而使得生产停止，另一方面，低水平的甲醇会触发外源蛋白的水解降解，导致生产力降低。山梨醇与甲醇的共同添加可减少中间代谢物的毒性作用和氧消耗，同时也减少了特定蛋白酶的产生，也消除了乳酸的积累期。
温度对发酵的影响：一般毕赤酵母所需的生长温度为28～30 ℃，高于32 ℃可能导致细胞死亡。一些研究表明，毕赤酵母在较低的培养温度下发酵可以改善靶蛋白产量，降低细胞死亡率，减少死亡后细胞内蛋白酶向培养基中释放，进而减少外源蛋白的水解，而且在较低的培养温度下，蛋白质折叠应力通常会降低，从而使得毕赤酵母能够更加有效地分泌外源蛋白。
pH值对发酵的影响：pH值对毕赤酵母的影响主要包括以下方面：⑴影响细胞内酶的活性，进而影响细胞的新陈代谢，从而使外源蛋白的表达也受到影响；⑵影响细胞膜的通透性，对细胞吸收营养物质和排出代谢产物时产生一定的影响；⑶pH值会对培养基中成分和细胞的代谢产物的离解产生影响，从而对细胞吸收营养物质造成影响；⑷pH值也可能对细胞的代谢过程产生影响，使细胞代谢产物的含量发生改变。另外，在高密度发酵过程中，为了减少外源蛋白被蛋白酶降解，应避开蛋白酶作用的最适pH值，将pH值设定在偏离外源蛋白等电点处，也会提高外源蛋白的收获率。
溶氧量对发酵的影响：毕赤酵母的高密度发酵需要消耗大量的氧气，尤其是在利用甲醇时，溶氧不足会造成有害代谢产物在细胞中积累，产生有害影响。在高密度发酵中，使用发酵罐进行培养可以显著提高外源蛋白的表达水平，通常可高出摇瓶发酵的10～100倍。这是因为发酵罐相对于摇瓶会有更高的DO，会更有利于细胞生长及外源蛋白的表达。为了尽可能地提高培养基的溶氧量，生产上采用将纯氧和空气按照一定的比例混合这种通气方式来提高供氧，但是氧浓度太高（超过60%）细胞就会发生氧中毒，一般为保证足够的供氧DO会保持在20%～30%之间。
泡沫对发酵的影响：在高密度发酵中泡沫的产生是因为需要强烈的搅拌和曝气以及培养基中存在表面活性物质而产生，它对发酵生产的影响包括：⑴泡沫的形成会降低培养物表面的气体交换效率，因为它会在培养物和容器顶部空间的气体之间会形成屏障；⑵当气泡破裂时会产生剪切力，损害细胞和（或）任何分泌的蛋白质；⑶泡沫会将细胞和培养基带到泡沫相中，从而导致生产率降低；⑷泡沫也可能导致生产中无菌性的丧失。消泡可以采取添加消泡剂、机械搅拌或超声波的形式，最常用的方法是添加化学消泡剂。
甲醇的补料流加方式对发酵的影响：甲醇在毕赤酵母的发酵过程中起到两种作用：一是作为碳源提供能量，二是作为诱导剂，诱导外源蛋白的表达。因此，在发酵过程中甲醇的补加方式、用量和发酵时间都会影响到细胞的生长状态以及外源蛋白的产量。甲醇供应不足则会限制外源蛋白合成导致其表达量偏低，而如果甲醇过量则可能会对菌体造成毒性影响，进而抑制生长和表达，因此需要根据具体情况选择适宜的甲醇补加策略、用量和诱导时间，以最大化外源蛋白的表达同时保证菌体的生长和健康状态。目前，有几种方法可以用于调节甲醇的添加过程，这包括使用在线和离线甲醇监控仪器来控制流量、通过溶氧水平来控制甲醇的添加以及将甲醇与其他碳源混合后流加等，采用这些方法可以使甲醇的添加更加科学合理，从而提高外源蛋白的表达效率。
培养时间对发酵的影响：培养时间是在毕赤酵母表达系统中获得最高蛋白表达水平的最关键因素之一，在毕赤酵母表达系统中，生产时间相对较长（约100 h）。培养时间与酵母细胞的数量和目标蛋白的降解程度有关，较长的培养时间很可能会导致所表达蛋白被水解消化。
