生物制品中内毒素检测方法及去除工艺

学术 2024-09-22 07:41 吉林

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种脂多糖成分，是一种常见的病原体，细菌在生长、分裂或死亡过程中都会向环境中释放内毒素。内毒素是两亲性分子，由亲水性多糖部分和共价结合的疏水性脂质成分（称为脂质A）组成；多糖部分可分为两个结构域，核心多糖和O特异性抗原多糖，脂质A成分已被确定为内毒素活性的LPS 成分。内毒素的结构如下图：

生物制品在生产过程中常常会受到细菌内毒素的污染，从而对生物制品造成污染，其存在会严重影响生物制品的质量和安全性，进而对人体造成严重危害。内毒素通过引发炎症和激活免疫系统，导致多种生物学反应，旨在清除入侵的致病菌，但是过度的内毒素暴露或免疫反应失控可能导致严重病理生理反应，如发热、心动过速、呼吸急促、低血压、弥散性血管内凝血和多器官衰竭等。因此，如何有效地去除生物制品中的内毒素成为生物制品安全性与质量保障的关键。内毒素的结构特征就是去除细菌内毒素的基础，目前已形成多种内毒素去除工艺，包括超滤法、活性炭吸附法、萃取法、荷电微孔滤膜法、离子交换色谱法和亲和色谱法等。

内毒素作用分子机制：

细菌脂多糖是革兰氏阴性菌的一种膜糖脂，是单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞促炎反应的有效诱导剂，脂多糖结合蛋白（LBP）可与细菌内毒素脂多糖（LPS）直接相互作用形成复合物。CD14是一种单核细胞分化抗原，被确定为 LPS 的主要受体，与 LPS 具有高亲和力。当血液中有 LPS 时，LPS 与LBP 结合，然后结合细胞表面蛋白 CD14，形成 LBP-LPS-CD14 复合体。CD14 可以将 LPS 转运到 Toll 样受体 4（TLR4）及髓样分化蛋白 2（MD2）蛋白复合体，MD2 为 TLR4 的辅助蛋白，可以帮助 TLR4 识别 LPS，TLR4 属于跨膜蛋白，LPS 与 TLR4-MD2 结合后，TLR4 被激活，使得膜内基团的构象发生变化，将信号转到免疫细胞内部，激活髓样分化因子 88 （MyD88）、IL-1R 相关蛋白激酶（IRAK）和肿瘤坏死因子受体活化因子6等信号分子，从而引发 LPS 介导的一系列炎症反应。

内毒素检测方法：

内毒素是一种生物类毒素与外源性致热源，当人体内的内毒素水平超过一定范围时会对人体造成严重危害，所以生物制品的内毒素检测尤为重要。目前传统的内毒素检测方法是家兔热源法（RPT），即对家兔耳注射一定剂量的供试品后通过监测家兔体温检测热源即内毒素，但这种方法不能检测内毒素含量。鲎试剂试验法（LAL）也是内毒素的重要检测方法之一，在领域内被广泛采用，其原理是内毒素可以激活鲎试剂中的 C 因子、B 因子和前凝固蛋白，而使之变成凝胶状态，可以定量或者半定量地检测内毒素。但是随着鲎数量的减少，其他替代方法也相继出现，如单核细胞活性试验（MAT）法，该方法的原理为内毒素可以激活人单核细胞释放白细胞介素-6（IL-6），通过用ELISA 定量检测 IL-6 进行内毒素的定量分析；生物传感器是一种对生物性物质敏感并可将其浓度或含量转换为电信号进行检测的仪器；重组C因子法也是一种内毒素检测方法，重组C因子可以被内毒素活化，随后和荧光底物相互作用产生荧光，通过对荧光信号的检测实现内毒素的定量分析。此外，还有研究人员采用色谱或色谱-质谱联用技术对内毒素进行分析。

内毒素的去除方法：

①超滤法：超滤法是一种分子筛选技术，主要是利用滤膜的特殊结构和性质实现对物质的分离。内毒素相对分子质量较大，适用于去除小分子量物质中的内毒素，选用合适的超滤膜去除溶液中的内毒素。如通常可以选择截留分子量为10 kDa 的超滤膜对样品中的内毒素进行去除。超滤法具有操作简便、处理量大的优点，但并不适用于含有较大相对分子质量成分的样品。

②活性炭吸附法：活性炭是一种多孔介质，具有比表面积大、吸附能力强的特性，通过疏水作用对相对分子质量较大的内毒素进行吸附，在弱酸条件下去除效果更好，更适用于小分子溶液或低相对分子质量蛋白质或肽溶液中内毒素的去除。但是活性炭的选择性较差，对溶液中的活性成分也有吸附作用，并且吸附后溶液中残留活性炭的去除较为困难，因此目前使用较少。

③萃取法：有些生物制品的有效成分为带负电荷的生物大分子，并且含多糖结构，细菌内毒素不易去除，而萃取法利用目标分子或样品在两种互不相溶或微溶的溶剂中溶解度的不同而达到分离目的，因此可以在细菌内毒素去除中应用。如可以用 TritonX-114 对内毒素进行萃取，TritonX-114是非离子表面活性剂，在低温条件下，可以溶于水中并与内毒素分子结合，在温度升高的过程中，TritonX-114 的溶解度会逐渐下降，当温度超过 25 ℃ 时，TritonX-114会和内毒素一起形成沉淀，实现样品中内毒素的去除。

④荷电微孔滤膜法：荷电微孔滤膜是一种带有正电荷的滤膜，能够吸附带负电荷的物质。细菌内毒素的磷脂部分带负电荷，因此荷电微孔滤膜可以对其进行吸附，从而达到去除内毒素的目的。需注意使用该方法时内毒素的脱除率与荷电膜的孔径及溶液的pH有关，需对这些条件进行优化已达到最有的脱除效率。

⑤离子交换色谱法：内毒素在 pH ＞ 1.3 的情况下带负电荷，因此可以利用这一原理与阴离子交换色谱发生相互作用，柱上的内毒素可以用高盐缓冲液或 NaOH 去除。离子交换色谱法具有成本低、吸附容量大的特点，但若溶液中有效成分存在其他负电荷离子，则不适合采用该方法进行内毒素去除，否则可能会导致有效成分损失。

⑥亲和色谱法：亲和色谱法是通过物质之间的亲和作用，运用生物大分子可以特异性识别特定的物质并且进行特异性结合的原理来进行某种物质的分离的方法，此方法对物质的分离主要取决于亲和配基，因此选用可以与内毒素分子特异性结合的配基可以达到去除内毒素的目的。研究发现，以多粘菌素B 、组氨酸、聚赖氨酸、丝氨酸、壳聚糖为配基的亲和层析法对细菌内毒素有良好的吸附效果，可以有效去除细菌内毒素。亲和层析法因对内毒素有良好的选择性，因此可有效降低溶液有效分子的损失。

各种去除细菌内毒素的方法不是孤立的，可以相互结合使用，在设计整个工艺流程时需要考虑到每一个步骤对内毒素的去除效果以及不同来源样品的内毒素在性质上的区别，需要结合工艺流程和特殊性质进行确定。

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