细胞培养技术介绍

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一、细胞培养的条件和要求

1.所有与细胞接触的设备、器材和溶液等，都必须保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染。

目前最可靠和最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。如：玻璃制品、布类、金属制品：6.8kg20min;橡胶制品：3.6～4.5kg10min;培养用液，如Hanks液，水解乳蛋白：3.6～ 4.5kg10min;实验中染菌物品和动物尸体等：6.8 kg20min;试管、吸管等，则可采用干热灭菌；一切不适于加热灭菌的液体，如人工合成培养液、小牛血清、胰蛋白酶等溶液，可采用过滤法除菌。

2.必须有足够的营养供应，而绝对不可有有害的物质，包括极微量的有害离子的掺入，为此必须注意器材的清洗和配液用水的质量，细胞培养中对水的质量要求很高。

3.保证有适量的氧气供应，细胞代谢需要有空气，否则细胞死亡。在用培养瓶进行静止培养，或用转瓶进行旋转培养时，只要培养的液体量不超过总容量的30％，通过与液面的空气交换，可以保证细胞有足够的氧气。当用罐子深层培养时，则必须通气，一般采用含5％CO₂的空气，或根据需要将CO₂、N₂、O₂和空气以不同比例混合，过量氧对细胞的生长也不利。

4.需随时清除细胞代谢中产生的有害产物，细胞在代谢过程中会产生大量代谢废物，如CO₂、乳酸、氨、尿素、吲哚等，这些产物对细胞的生存有害，必须及时清除。在小量培养时，当培养基中酚红指示剂显示黄色，表示已有相当量乳酸产生，要及时更换新鲜的培养基。在大量培养时，则需随时测定葡萄糖和乳酸等含量，并调节灌流速度，使代谢产物保持在无害水平下。

5.有良好的适于其生存的外界环境，包括温度、pH、渗透压和离子浓度等。不同的细胞对pH的要求不同，一般来说适于细胞生长的pH在6.8～7.4，过高或过低均不利于细胞生长。如上所述，细胞在代谢过程中会产生大量乳酸，使培养的pH下降。为了保持培养液的pH，常在培养液内加入各种缓冲系统，如Na₂HPO₄/Na₂HPO₄、NaHCO₃/H₂CO₃（CO₂）、Tricineglycine，以及加缓冲剂Hepes液（常用浓度为10～50mol/L）。

6.及时分种，保持合适的细胞密度。

二、细胞分离

1.人白细胞的分离。

常用于IFN－α和γ的制备。它主要来源于献血者的静脉血，也可来自手术时体外循环剩余血，分娩时脐带血，以及脾脏和扁桃体等组织。

2.人胚肌皮细胞的分离 。用于IFN-β的制备。

三.体外培养细胞龄的计算

二倍体细胞龄以细胞群体倍增计算，以每个培养容器细胞群体细胞数为基础，每增加一倍作为一世代，即1瓶细胞传2瓶（1：2分种率）再长满瓶为一世代；1瓶传4瓶（1：4）为二世代；1瓶传8瓶（1：8）则为三世代。生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的前2/3内。

传代细胞系则以一定稀释倍数进行传代，每传一次为一代。依据每个细胞系的实践经验数据，确保细胞质量及安全，确定生产使用细胞最后限制代次。

四.细胞鉴别试验

新建细胞系或株、细胞库和生产结束时的细胞应进行鉴别试验，以确认为本细胞。可采用遗传特征、DNA指纹图谱、染色体标记、免疫学、HLA和生化法（如同功酶）测定，任选其中一种方法。有简便而能鉴别的方法亦可采用，但需经国家药品检定机构认可。人二倍细胞株来源于正常人胎肺或其他组织，主要用于培养病毒制备疫苗等。

1.细胞株的要求

人二倍体细胞株须按下列要求进行全面检定。

（1）建立细胞株必须具备下列资料

建立细胞株所用的胎儿的胎龄和性别，终止妊娠原因。建立细胞株所用的胎儿父母的年龄、职业及健康状况（经医生出具证明），胎儿父及母系三代应无明显遗传缺陷疾病历史。在取胎儿组织前，应做出详细调查。原始组织种类，原始细胞培养的细胞数量与生长的状况。

细胞培养方法、历史、生长特征和寿命的世代数。细胞生长液的成分。

（2）细胞株的检定

染色体检查，新细胞株建株过程中，每8～12世代应作一次染色体检查，一株细胞整个生命期内连续培养过程中，至少有4次染色体检查结果。细菌、真菌、支原体及病毒检查

致肿瘤性检查 ：每8～12世代，做一次细胞株异种移植试验，观察细胞株有无致瘤性质。

2.定义和术语

原代细胞来源，包括猴肾、鸡胚、地鼠肾、家兔肾、狗肾和鹌鹑胚，以及其他组织等。原代细胞是用正常组织，以适当的消化液分散细胞进行培养。原代细胞培养是以适当的消化液消化正常动物组织以分散细胞，培养成单层细胞直接用于生产，只限于原代或少数几代（一般1～5代）内，用于生产的细胞以生物学性状不发生改变为原则。细胞生长（营养）液：是提供细胞生长繁殖的培养液，可含少量动物血清，多为小牛或胎牛血清（常用10％）。细胞维持液：是提供细胞维持正常新陈代谢的培养液，不含动物血清（或少量，常用2～5％），只维持细胞正常生存，可满足病毒复制等。

3.鸡胚细胞的分离，在IFN研究中常需要它来制备测定IFN活性的水泡性口炎病毒（VSV），以及用以滴定病毒。

4.常用消化液的配制方法：

（1）1％胰蛋白酶溶液的配制：

①取胰蛋白酶10g（一般采用活力为1：250的胰蛋白酶，即1份胰蛋白酶能解离250份酪蛋白）；

②用少量Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状；

③补足Hanks液至1L，振摇混匀，置4℃冰箱内过夜；

④用G6玻璃滤器或用分子滤膜过滤除菌；

⑤分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用，同时取样作无菌试验；

⑥使用时用Hanks液稀释成0.25％或0.125％，并用NaHCO3调至pH7.0或偏碱。

（2）0.02％EDTA溶液的配制：

①称取EDTA0.2g；

②用1Lhanks液溶解；

③15～20min高压灭菌；

④分装小瓶，4℃冰箱保存备用。

（3）胰蛋白酶－柠檬酸盐配方：

胰蛋白酶（1：250）2.5g；

柠檬三钠2.96g；

氯化钠6.15g；

酚红（1％）1.5ml；

无离子水加至1L。

用NaOH调至pH7.8（约1mol/L NaOH 2ml），用滤纸粗滤，用G6玻璃漏斗过滤，分装小瓶，低温冰冻保存，并作无菌试验

（4）胰蛋白酶－EDTA溶液的配制：

1份0.25％胰蛋白酶－柠檬酸盐；4份0.02％EDTA溶液。

五、细胞计数

1.计数方法

（1）先用培养基将细胞悬液作适当稀释。

（2）用吸管吸取少量细胞悬液，滴于计数板上盖玻片一端，让液体自动进入盖片下间隙，勿留气泡。

（3）镜下观察并计算出四角大格内的细胞数，计数时注意只计上线和右线的细胞。

按下式计算细胞浓度：

细胞数/ml＝4大格中细胞总数÷4×10000×稀释倍数

2.区别细胞死活的方法

（1）台盼蓝

（2）苯胺黑

（3）结晶紫－柠檬酸

六、细胞传代

1.悬浮细胞地传代 ：

悬浮细胞的传代比较容易，只要加上一倍或几倍的生长液，然后分种几只培养瓶即可。

2.贴壁细胞的传代：

贴壁细胞需经消化后分种 。

七、细胞的冻存和复苏

1.细胞的冻存

降温步骤：逐步降温

2．细胞的复苏

复苏时总的要求是快融

八、细胞培养用水处理

细胞培养对水质的要求很高，不仅不能有微生物污染，而且也不能有有害的离子存在，一般均采用蒸馏和离子交换相结合的方法，最后再通过除菌灭菌。一般要求水的电阻值大于18MΩ。所谓纯水离子交换和除菌器是将原水中的盐类，游离酸，碱，微生物及其他杂物全部除去的处理方法。用此法制造的纯水要比蒸馏水纯得多。

九、选择小牛血清的微量细胞培养检查法

在细胞培养时，除了培养基以外，常常需要加入一定 量的动物血清，最常用的是小牛血清。它的作用机制还不十分清楚，但至少它可以给细胞提供在它生长中所必需的各种激素，各种生长因子以及脂类、蛋白和无机物等。由于血清批与批之间质量相差很大，有的甚至有明显的细胞毒性（原因还不清楚），因此在使用前必须先作检查，以确定其是否适用于培养的细胞。

十、葡萄糖测定法

为了保证细胞良好的生长和增值，必须及时地补充所消耗的营养，由于细胞在代谢中主要利用葡萄糖作为能源，因此葡萄糖的消耗可以作为观察细胞增长和调节营养补充速度的指标，是细胞培养中必须掌握的一个重要参数。采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（GOD-POD）比色法中Trider法，又称4-氨基安替比林偶联酚法（4-AA酚法）。

1.原理

利用GOD氧化葡萄糖时产生的H2O2,在POD存在时把还原型生色原氧化为氧化型生色原，其产量与血糖浓度成正比。其反应式略去

2.试剂

采用解放军302医院葡萄糖酶法试剂诊断盒，其中含葡萄糖试剂，葡萄糖酶试剂，葡萄糖标准液（100mg/dl）。

3.操作方法

取25ml蒸馏水将葡萄糖试剂溶解，加葡萄糖酶试剂0.5ml，轻轻混匀即为工作试剂。按上述所列程序分别加入葡萄糖标准液、样品和工作试剂。37℃恒温水浴10min。用WFZ800－D3A紫外/可见分光光度计，波长500nm比色，读取吸光度。

样品管吸光度/标准管吸光度×100（标准液浓度）＝样品中葡萄糖（mg/dl）

4.注意事项

（1）原酶及用剩的酶试剂放-4℃～-18℃冰箱保存，不能冻结。葡萄糖试剂用棕色瓶避光常温保存。

（2）工作试剂要现用现配，以防时间过久变性。

（3）加样要准确，最好用微量加样器。

十一、乳酸测定法

细胞培养期间随着细胞密度的增加，细胞生成的乳酸产物会大量积蓄，引起培养基pH下降，从而不利于细胞的生长，小量培养时，可根据酚红的颜色及时换液，但大量培养时，由于pH的自动调节，无法观察酚红的颜色，只有通过测定来确定乳酸含量。

1.试剂

10％三氯乙酸（CP）；4％硫酸铜溶液；浓硫酸（GR）；1.5％对羟基联苯（精确称取对羟基联苯1.5g置于0.5％NaOH溶液中加热搅拌至溶解，其最终体积为100ml，置于棕色瓶中，可保存半年）；乳酸标准储存液（1mg/ml，精确称取乳酸锂106.6mg，GR，德国Merck厂出品，置于100ml容量瓶中，用10％三氯乙酸稀释至刻度，室温中可保存半年以上）；乳酸标准应用液10μg/ml（吸取1ml乳酸标准贮存液放入100ml容量瓶中，用10％三氯乙酸稀释至刻度，室温中可略保存2个月）；1％氟化钠溶液。

2.乳酸测定原理

乳酸与硫酸共热生成乙醛，在Cu2+存在时，乙醛与对羟基联苯作用，生成紫色化合物，其颜色的深浅与乳酸浓度成正比。

3.方法

取大试管若干个分别作空白管，标准管，测定管，并按顺序加入试剂，把试管放在液体快速混合器上，充分混匀管内液体，随后沸水加热5min。取出试管放入冰浴冷却至5℃以下，加入1.5％的对羟基联苯每管1滴，并剧烈振荡混匀。混匀后置30℃恒温水浴保温30min，并每隔10min振荡一次。保温后取出放沸水煮90s，取出在冰浴中冷却至室温，用5mm比色皿，在560nm波长处，以空白管野兔调零点，读取各管吸光度。

计算结果：

100×测定管吸光度/标准管吸光度＝培养液中乳酸mg%，或100×测定管吸光度/9×标准管吸光度＝培养液中乳酸mmol/L。

（1）加浓硫酸时，要把试管放在冰水中，慢慢滴入硫酸。以免发生局部过热反应。

（2）应用大功率加热器，试管在沸水浴中加热5min时，水温必须保持在90℃以上，使乳酸转变成乙醛。

（3）加对羟基联苯溶液后必须剧烈振摇，使沉积物成小颗粒。

（4）恒温水浴的温度要严格控制在30℃，如温度升高，可使样品显色不完全，引起吸光度降低。

（5）严格控制样品在沸水浴中煮沸90s。

（6）使用500μl加液器，其应慢慢按下活塞，使液体全部排除。按活塞过快，会使部分液体遗留在壁上，影响测定结果的准确性。

（7）有时样品不显色是由于没加硫酸铜溶液，如果在加羟基联苯后补加硫酸铜，则对测定结果无影响。

十二、细胞培养方式

1.静止培养：应用细胞管，多孔板，空斑瓶，罗氏瓶等。培养时静止不动。

注意以下几点：

（1）培养量一般不要超过总体积的1/3，液体厚度不要超过1cm，这样就可以有足够的空间以保证细胞培养中对氧的需要。

（2）若用普通孵箱培养，必须盖紧盖子或塞紧橡皮塞，或贴紧胶纸，以防培基碱化，如用CO₂孵箱培养则不要盖紧瓶盖，并将CO₂浓度控制在5％、

（3）一般2d换一次液，细胞长成单层要及时分种传代。

（4）用过的培养瓶可再次使用，但不要超过3次，一般来说，静止培养的细胞质量较好，产量也高，故有人将其扩大成多层盘，用以大量生产HuIFN－β。

2.旋转培养

应用转瓶并放置在转床上培养。该法较静止培养更能多地利用培养面积，并使细胞更好地进行气体交换。它是经典的用以生产生物制品的培养方式，目前仍被广泛采用。为了进一步增加面积，有人在转瓶内加入多层同心圈。

3.悬浮培养

它适于一切能在悬浮条件下生长增殖的细胞，即非贴附依赖性细胞。用于该类细胞培养的设备结构基本与培养细菌的相同，一般将用于细菌培养的称为发酵罐，用于细胞培养的称为生物发应器。一般小于5L的可采用玻璃罐，玻璃要求用低碱的硼硅酸盐玻璃，大于5L的改用不锈钢或肽钢。

4.微载体培养

它适于一切贴附依赖性细胞，即贴壁细胞的培养，这类细胞与悬浮细胞不同，必须贴附于物体表面才能生长。为了增加单位培养容积内的表面积，1967年荷兰的van Wezel创造了用葡聚糖制成微球，即微载体培养贴壁细胞的新技术，到80年代已被正式用于HuIFN－β的工业化生产。

理想的微载体需具备如下一些条件：表面性质适于细胞的附着、伸展和增殖。微载体的比重在1.030～1.045g/ml，使载体在低速搅拌时就可悬浮，而在静止时又可很快沉降，便于换液和收获。大小以直径在100～230μm为好，并要尽可能地均一，这样有利于细胞均匀地分布于各微载体表面。透明，适于在倒置显微镜下观察细胞在载体上的生长情况。无毒性、不仅要求对细胞的生长无毒性，而且也不会产生有害因子于培养基内。基质的性质最好是软性的，避免在搅拌中由于载体相互摩擦损伤细胞。

5.微载体培养的传代和扩大培养

6.微载体的再生回用

为了降低载体的消耗，有些类型的微载体还可以再生利用。

7.巨载体和微囊培养

它与微载体培养不同，细胞不是贴附在载体表面而是包埋在凝胶载体或微囊内，因此它们被统称为包埋法。由于有的凝胶载体制备得较大，直径2～3mm，因此又称为巨载体培养。

8.多孔微球培养

它把微载体和巨载体两者优点结合在一起，细胞既可附着在载体表面，又可以渗入载体较大的孔隙而生长在载体内。1985年Verax公司介绍了它们的产品IMMO微球，并成功地用以生产单克隆抗体。

9.中空纤维培养

该培养器模拟机体的毛细血管系统，由数百乃至数千根中空纤维集束组成。该纤维的材料为聚砜或丙烯共聚物，纤维壁厚50～75μm，成多孔性。内层为超滤膜，可用以截留不同分子量的物质，内径200μm，两端用环氧树脂等材料将纤维粘合在一起，并使内腔开口于外加塑料圆筒内，使形成两个隔开的腔。内腔用以灌流充以氧气的培基，外腔用以培养细胞。细胞可附着于纤维表面，也可渗入海绵状纤维壁，1至3周后细胞可占据所有纤维内空间，并在纤维表面堆积成多层，细胞密度可达 106～10⁷/cm²。此时细胞的分裂处于停顿，但其它代谢和分化功能可保持数日之久。

10.灌流培养

有人称它为过滤培养法，它的特点是在培养过程中，不断地灌流补充新鲜培基，同时不断地排走已消耗的培基以及细胞在代谢过程中产生的有害物质，这样就可大大提高细胞的培养密度，也就提高了细胞产物的产量。

为了进行灌流培养大致有如下4种方法：

①附加有滤孔直径小于微载体或细胞的滤器；

②采用中空纤维超滤器；

③利用流化床反应器；

④采用特制的排液柱。