国自然热点：“精氨酸甲基化+超级增强子”的巧妙整合

今天的我文章是威斯康星大学麦迪逊分校医学院许伟教授团队在Nucleic Acid Research（IF：14.9）上发表的题为“BAF155 methylation drives metastasis by hijacking super-enhancers and subverting anti-tumor immunity”的研究论文。

该研究利用多种先进分子生物学实验，包括染色质免疫沉淀（ChIP）、ChIP-seq、RNA-seq分析和循环肿瘤细胞（CTC）检测等，以TNBC细胞系为研究对象，深入揭示了甲基化-BAF155（me-BAF155）在促进肿瘤转移中的双重作用，探究了SWI/SNF亚基精氨酸甲基化的独特机制。该研究发现，精氨酸甲基化修饰的BAF155蛋白可以通过操纵增强子、破坏机体的抗肿瘤免疫能力，从而促进恶性肿瘤的转移。该机制驱动表观遗传失调，并将me-BAF155确立为增强免疫治疗效果的治疗靶点。

2014年，许伟课题组在Cancer Cell发文，首次证实了CARM1能够通过甲基化修饰BAF155蛋白第1064位精氨酸，起到促进TNBC转移的作用。本文在这篇研究的基础上，将精氨酸甲基化、超级增强子、肿瘤免疫和循环肿瘤细胞联系起来，深入挖掘me-BAF155依赖性癌症转移的机制。可见，国自然热点的关联碰撞，这样具有逻辑性和创新性的课题，更能够受到审稿人的青睐。

原文链接:

https://academic.oup.com/nar/article/49/21/12211/6431811?login=false

1 Me-BAF155基因组结合位点与BRD4在超级增强子上的结合位点基本重叠

先前的研究表明，me-BAF155可促进TNBC模型中的癌症转移。在这里，作者采用ChIP-seq技术对me-BAF155的基因组结合位点进行全局定位分析，发现me-BAF155和BRD4在SEs的两个染色质特征H3K27Ac和H3K4me1处共定位（图1 A-F）。接下来，为了研究BRD4与SEs的关联是否依赖于BAF155甲基化，作者使用CRISPR/Cas9敲除（KO）BAF155并重新表达野生型（WT）BAF155或两个甲基缺陷突变体BAF155R1064K型和BAF155R1064A型，通过qRT-RCR证实了BAF155 KO或BAF155突变表达细胞中转移诱导因子的下调和转移抑制因子的上调（图1 G-H）。另外，在MDA-MB-231细胞上检测BRD4基因组占有率,发现两个甲基缺陷突变体的BRD4占有率显著降低；通过ChIP-q-PCR验证了先前鉴定的几个CARM1调节的转移相关基因结果显示，BAF155 KO或BAF155突变体中me-BAF155和BRD4在这些基因上的占有率的占有率显著降低，但在WT BAF155中没有显著降低，表明me-BAF155调节BRD4与SEs的结合（图1 I-J）。

2 CARM1抑制剂（CARM1i）根除SEs处的BRD4和me-BAF155结合位点，并降低SEs成瘾的癌基因的表达

使用BET抑制剂（BETi）对BET蛋白进行药理学抑制是一种常用的抗炎和抗癌表观遗传治疗方式。为了进一步研究me-BAF155和BRD4之间的功能关系，作者用BETi JQ1或CARM1i-TP-064处理TNBC细胞，发现抑制剂处理减弱me-BAF155调节的转移基因的mRNA水平，且与这些基因上减少的me-BAF155和BRD4结合一致，而且TP-064和JQ1处理对SEs的me-BAF155和BRD4基因组占有率峰均显著降低（图2 A-D）。此外，TP-064和JQ1处理将细胞中的SE数分别降低到15和31；TP-064和JQ1处理降低了几种SE调节的致癌基因的蛋白表达（图2 E-F），而且，BRD4和me-BAF155基因组位点主要聚集在增强子上，但在启动子中较少,对基因组位点变化的进一步分析表明，TP-064消除了启动子和增强子区域的BRD4和me-BAF155基因组占有率，而JQ1仅有效降低BRD4占有率，但对me-BAF155结合的影响较小（图2G）。这些结果表明，抑制BAF155甲基化对BRD4募集到SEs具有深远影响，而JQ1只抑制BRD4，不影响me-BAF155基因组结合。

进一步的免疫共沉淀测定结果表明，BRD4与BAF155和me-BAF155存在相互作用，并且JQ1抑制me-BAF155和BRD4之间的相互作用，邻位连接测定也发现me-BAF155与BRD4在细胞核中共定位，JQ1和TP-064处理减少了BRD4和me-BAF155 之间的相互作用（图2H-J)。总的来说，CARM1抑制使me-BAF155和BRD4与SEs解离，抑制SEs调节的癌基因表达。

3 TP-064在TNBC细胞中表现出低细胞毒性作用，抑制细胞迁移并与JQ1协同作用

基于上述实验发现的CARM1i对BRD4和me-BAF155基因组关联以及癌基因表达的抑制作用促使作者评估CARM1i在增殖和迁移中的功能效应。首先，WB结果显示TP-064对BAF155和PABP1甲基化的剂量和时间依赖性抑制以及TP-064抑制BAF155和PABP1甲基化的IC50分别为0.59μM和0.40μM（图3A-B）。细胞周期检测结果表明，TP-064不影响细胞周期，而JQ1处理导致细胞中的G0/G1停滞，且JQ1不仅增加了有丝分裂持续时间，还增加了凋亡细胞和异常细胞分裂（图3C-E）。此外，单细胞水平细胞迁移测定结果显示，与载体和JQ1处理相比，TP-064显著降低了迁徙速度和移动距离（图3F–H)。

由于BETi已被广泛研究用于与多种治疗的联合应用，因此作者评估了JQ1和CARM1i是否对细胞增殖和迁移产生协同作用。首先，以剂量依赖性方式测量了TP-064和JQ1单独和联合使用的细胞毒性作用，结果表明，与单独使用JQ1或TP-064相比，联合使用显著抑制细胞存活率和细胞增殖,即使是JQ1抗性细胞系SUM159R（图3I-L）。Transwell试验比较了TP-064和JQ1对细胞迁移的影响，令人惊讶的是，TP-064抑制了MDA-MB-468细胞的迁移，而JQ1促进了MDA-MB-468细胞的迁移（图3M）。这些结果表明，尽管JQ1和CARM1i都抑制了共同的靶点，但这两种抑制剂影响非重叠的靶点和通路。因此，BETi和CARM1i的组合引发了协同的抗生长和抗迁移作用，并且CARM1i在JQ1抗性细胞中仍然有效。

4 BET和CARM1抑制剂消除了PDX模型的肿瘤生长和转移

接下来，作者研究了BETi和CARM1i在HCI-002（一种代表TNBC的PDX模型）中的体内效应。JQ1、CARM1i-EZM2302单独或联合治疗可显着降低HCI-002肿瘤生长（图4A-B）。然后，从每个治疗组收集肿瘤进行RNA-seq分析，基因集富集分析和qRT-RCR、WB都显示，JQ1、EZM2302或其组合下调了HCI-002中SEs特征基因及蛋白的表达（图4C-E）。此外，JQ1和EZM2302显著降低Ki67染色强度，表明这些药物在HCI-002中具有抗增殖作用（图4F）。

据报道，HCI-002会在淋巴结中形成微转移，从用JQ1、EZM2302或联用处理的小鼠中采集淋巴结组织，并用人类特异性线粒体抗体染色。与载体治疗相比，两种药物都被发现抑制微转移（图4G）。上述结果表明，抑制BET或CARM1显着阻断PDX模型中肿瘤生长和转移，并且可能是通过抑制SE调节的癌基因的表达。

5 BET和CARM1抑制剂在4T1同基因小鼠模型中的差异效应

为了检查JQ1和EZM2302在免疫感受态乳腺肿瘤模型中的体内效应，作者将4T1.2（一种可自发转移的小鼠细胞系）原位植入到同基因Balb/c小鼠中。EZM2302显着降低了肿瘤生长，然而JQ1却显着增加了肿瘤的生长，联合治疗抵消了JQ1的肿瘤促进作用，JQ1促进4T1.2肿瘤细胞的肺转移，而EZM2302抑制肺转移（图5A-E)。由于JQ1在免疫缺陷PDX模型和4T1.2同基因模型中观察到的不一致结果，作者推测BETi和CARM1i可能对免疫细胞有不同的影响。为了验证这一假设，通过流式细胞术量化了4T1.2荷瘤小鼠肺组织中存在的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的数量，结果显示，EZM2302治疗增加了肺部的CD8 T细胞水平（图5F-G)。

为了研究CD8的靶向阻断是否能拮抗或消除EZM2302的治疗效果，单独使用EZM2302治疗4T1.2肿瘤，或与抗CD8单抗联合治疗，然后测量生存率、肿瘤生长、转移和CD8 T细胞浸润。结果显示，在抗CD8治疗组中观察到肿瘤快速生长，当给予更高剂量的抗CD8单抗时，小鼠在两周内死亡，而EZM2302延长生存期（图5H-I)。对低剂量抗CD8单克隆抗体组、EZM2302组和联合治疗组的原发肿瘤生长和转移监测的结果表明，EZM2302与抗CD8单抗的共同处理显著逆转EZM230对肿瘤生长和转移的抑制作用（图5J-K)。在进一步量化了治疗条件下（10、20和30天）的肿瘤浸润CD8/CD45 T细胞结果显示，抗CD8单克隆抗体可减少CD8 T细胞，EZM2302治疗增加局部肿瘤浸润CD8 T细胞（图5L）。综上所述，CARM1i增强了CD8 T细胞的细胞毒性作用，而JQ1抑制了CD8 T细胞的细胞毒性作用，这解释了这些表观遗传药物在免疫功能正常的4T1.2模型中的差异作用。

6 CARM1抑制剂通过诱导BCL11A/PBAF复合物的形成和H3K27Ac水平升高来激活IFN α/γ通路基因

首先，使用MDA-MB-468细胞、HCI-002肿瘤和4T1.2肿瘤进行RNA-seq，以鉴定由JQ1、CARM1i或两者诱导的差异表达基因（DEG)，JQ1在所有三个模型中都诱导了更多的DEG，当JQ1和CARM1i联合时，JQ1是基因表达的主要调节因子（图6A)。基因富集显示JQ1抑制干扰素（IFN）反应性通路，而这些通路在三种不同的模型中被CARM1i强烈激活，并通过qRT-PCR验证IFN α/γ刺激基因（ISGs）被CARM1i激活，但是，单独用JQ1治疗或其与CARM1i联合治疗ISGs受到抑制（图6B-D）。

为了探究CARM1i和JQ1对ISG的差异调控机制，作者将RNA-seq结果整合到MDA-MB-468细胞中响应TP-064和JQ1处理的ISG的me-BAF155、BRD4和H3K27Ac ChIP-seq数据中。有趣的是，一部分ISG的H3K27Ac升高，而TP-064处理降低了me-BAF155和BRD4基因组占有率（图6E-F)。相反，JQ1抑制许多ISGs的表达，伴有H3K27Ac水平略有降低或不变，JQ1介导的抑制和CARM1介导的ISG激活在体外和体内都是保守的，如JQ1的MDA-MB-468和HCI-002数据之间的强相关性所示（图6G）和CARM1i（图6H）治疗。TP-064激活了MDA-MB-468细胞中的ISG，并在HCI-002中激活了EZM2302 ISG（（图6H）。这些数据表明，CARM1i在多个TNBC模型中可能是通过提高这些基因位点的H3K27Ac水平来激活IFN α/γ通路。

接下来，通过分析ISG H3K27Ac ChIP-seq峰处的TF结合基序，识别与H3K27Ac峰相关的主要TF包括ZN770、STAT2、IRFs和BCL11A，且WB结果表明TP-064诱导BCL11A蛋白的时间依赖性增加（图6I-J）。BCL11A是哺乳动物SWI/SNF复合体的不可分割亚基，即BRG/BRM相关因子（BAF）、多溴相关BAF（PBAF）和非经典BAF（ncBAF）复合体。因此，为了进一步确认BCL11A是否与TP-064处理下的PBAF复合物优先相关，在DMSO或TP-064处理后使用甘油密度梯度从MDA-MB-468的核裂解物中分离出不同形式的SWI/SNF复合物，结果表明在ISG处发现BCL11A的结合增加，但在SE位点的结合程度较小，TP-064处理后BAF155和PBAF亚基的结合程度较低。此外，TP-064处理触发了HDAC1的解离，并增加了ISG上Ac-p300和H3K27Ac的水平（图6K-M）。为了确定TP-064诱导的ISG激活是否需要BCL11A，敲低BCL11A并通过qRT-PCR测量代表性ISG的mRNA水平，结果表明，敲低BCL11A可消除TP-064对ISG的激活（图6N-O）。综上所述，这些数据强烈支持，CARM1抑制时，BCL11A被激活并可能与PBAF结合，通过诱导组蛋白乙酰化（即增加Ac-P300的募集和HDAC1的解离）来激活ISG。通过这种机制激活IFN α/γ通路基因，导致免疫反应增强，增强抗生长和抗转移作用。

7 转移性乳腺癌患者CTC中me-BAF155的免疫染色

从7名转移性乳腺癌患者中收集血液，捕获EpCAM+细胞，用Hoechst或靶向细胞角蛋白、me-BAF155和排除标志物（CD45、CD34和CD66b）的抗体染色，结果显示，对于所有患者，me-BAF155均可在细胞角蛋白阳性染色的CTC中检测到（图7A-B）。随后监测了患者BC-548的me-BAF155水平，该患者在三年内TNBC稳定。IF结果显示，尽管CTC的数量随着时间的推移而显着增加，但me-BAF155水平在三年内保持稳定（图7C-D）。