国人佳作——西南医大附院江涌团队揭示乳酸化影响星形胶质细胞线粒体转运新机制

本篇文章由西南医科大学附属医院神经外科为第一单位在Cell  Metabolism（IF：27.7）上发表，通过运用4D乳酸化修饰组学，阐明了低密度脂蛋白相关受体蛋白1（LRP1）对星形胶质细胞线粒体转运的重要调控作用。首次揭示了LRP1通过调节细胞代谢影响ADP-核糖基化因子 1（ARF1）的乳酸化修饰，进而调控星形胶质细胞-神经元细胞间线粒体转移，这一过程可以拮抗缺血所造成的器官损伤。

https://doi.org/10.1016/j.cmet.2024.05.016

低密度脂蛋白受体相关蛋白-1（LRP1）是属于低密度脂蛋白受体家族的多功能跨膜受体，属于LDLR家族。在生物体内广泛表达，LRP1在多个组织中调节多种细胞功能，包括神经元稳态、心肌梗死、能量代谢和阿尔兹海默症AD等相关发病机制。但LRP1是否以及如何维持大脑稳态及其在缺血性脑卒中中的作用仍有待阐明。

线粒体通过ATP生成、代谢调节、Ca2+缓冲和细胞应激反应等多种功能对维持细胞健康至关重要。线粒体构成一个动态网络，影响细胞内各个部分以及细胞和组织之间的通讯。星形胶质细胞释放多种对神经元发育、信号传导、生长和突触发生至关重要的因子，并且星胶支持神经元健康的一个重要方式是将细胞外健康的线粒体捐赠给受损的神经元。

本研究中鉴定了一个之前未知的LRP1在星形胶质细胞-神经元通路中的功能。利用体内外模型，观察到星胶细胞LRP1调节健康线粒体从星胶向神经元的转移，并对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。抑制星胶LRP1减少了线粒体向受损神经元的转移，加重缺血性中风。在星胶中，LRP1抑制葡萄糖摄取、糖酵解和乳酸生成，从而导致ADP-核糖化因子1（ARF1）的乳酸化降低；进一步检测了人类缺血性卒中患者的乳酸水平。与正常对照相比，缺血性卒中患者脑脊液( CSF )乳酸增加，支持了小鼠模型中乳酸抑制功能性线粒体转移和恶化缺血再灌注损伤的发现。

图1 星形胶质细胞LRP1促进线粒体向神经元转移 

线粒体在细胞能量代谢中发挥核心作用，反过来，营养状态影响线粒体功能。为了探索LRP1介导线粒体转移的代谢机制，作者对表达sh-Lrp1的星形胶质细胞进行了靶向代谢组学分析。在A图中观察到，在敲低LRP1的星胶中观察到细胞内葡萄糖和糖酵解中间产物3-磷酸甘油醛和乳酸的增加，以及TCA循环中间体，包括琥珀酸、草酰乙酸和苹果酸在sh-LRP1组中也显著上调。随后通过检测星胶中OCR和细胞外酸化率（ECAR）来验证代谢变化。与对照相比，敲低LRP1星胶中糖酵解和TCA代谢产物的积累增加，B图OCR和C图ECAR均增加，以及D图中ECAR/OCR比值也显著增加，表明相对于氧化磷酸化，敲低LRP1后细胞中的糖酵解水平增强。

为了检测敲低LRP1的星胶中糖酵解的增加是否是由葡萄糖摄取增加引起的，作者使用同位素标记的葡萄糖处理星胶，结果如E图所示与对照相比，敲低LRP1显著增加了星胶对葡萄糖的摄取情况。

在中枢神经系统中，乳酸主要由星形胶质细胞中葡萄糖和糖原的糖酵解分解产生。与对照相比，FG图中敲低LRP1的星胶和细胞外培养基中乳酸水平增加，伴随着H图乳酸脱氢酶（LDH）活性的增加，以及I图中LDHA/B的蛋白水平升高，表明有氧糖酵解的激活。除糖酵解外，乳酸还可以通过谷氨酰胺和乙酸的氧化产生（图2J）。为进一步研究敲低LRP1后星胶乳酸增加的来源，作者进行了13C示踪实验，分别用U-13C葡萄糖、U-13C谷氨酰胺或U-13C乙酸标记星形胶质细胞，并分析随后13C整合到乳酸和TCA循环代谢物中（图2J）。k图中在星形胶质细胞中，谷氨酰胺或乙酸仅在很小的程度上被转运到乳酸中，因此似乎不是乳酸产生的主要贡献者；L图中大部分乳酸由葡萄糖产生，敲低LRP1增加星形胶质细胞中乳酸的产生。这些结果表明星胶敲低LRP1通过糖酵解途径产生更多的乳酸。

图2 敲低LRP1促进星形胶质细胞糖酵解和乳酸代谢

接下来，作者试图确定乳酸生成增加是否影响星形胶质细胞线粒体释放。A图中作者用缺氧处理星形胶质细胞以生理性诱导无氧糖酵解过程。缺氧刺激引起B图中ACM细胞内乳酸增加，细胞外线粒体和ATP水平降低，暗示了缺氧可能会抑制线粒体释放。相反，用2-脱氧-D-葡萄糖( 2-DG )抑制糖酵解进程，一种不可代谢的葡萄糖类似物，结果表明C图中抑制了胞内乳酸的产生，并导致细胞外线粒体和ATP产生的激增。

LDH包括LDHA和LDHB两种亚型，催化丙酮酸和乳酸之间的可逆反应。为了检测LDH是否是星胶线粒体释放所必需的，作者使用LDHA/B的选择性抑制剂处理星胶，D图中与对照相比，抑制剂处理降低了星胶乳酸产生，增加了细胞外线粒体和ATP水平。并且E图中LDHA和LDHB双敲除抑制了50%的乳酸产生，增加了细胞外线粒体和ATP产生，这些效应被乳酸补充显著逆转。作者进一步证实，通过FG图结果得知LDHA和LDHB缺失完全阻断了抑制Lrp1后对线粒体释放的抑制作用，而过表达LDHA和LDHB则表现出与敲除Lrp1相似的作用。为了检测乳酸是否调节星形胶质细胞线粒体的释放，作者用梯度剂量的乳酸孵育细胞2 h，H图中乳酸处理以剂量依赖的方式降低细胞外线粒体和ATP水平，表明乳酸足以抑制线粒体释放。综上所述，这些发现表明LRP1通过抑制星形胶质细胞中的乳酸来增加线粒体的释放。

图3 乳酸抑制星形胶质细胞功能性线粒体的释放

与乳酸增加相一致，作者在敲低LRP1的星形胶质细胞中观察到A图中更高水平的全局蛋白赖氨酸乳糖基化（Kla），这是一种新的乳酸衍生的翻译后修饰。随后作者试图确定Kla蛋白对线粒体转移的影响，对表达对照和sh LRP1的星胶进行lactylome分析，B图显示从136个Kla修饰改变的蛋白中鉴定到163个赖氨酸残基。其中，84个蛋白定位于细胞核，32个蛋白定位于细胞质。值得注意的是，CDE图中ARF1第73位赖氨酸的乳糖化（ARF1Kla73）是细胞质中最高的高乳糖化赖氨酸残基之一。此外，F图中从G O注释的分子功能和细胞组分方面来看，ARF1与LRP1具有最高的功能相似性。此外G图对这些高乳酸化的胞质蛋白进行蛋白质-蛋白质互作网络分析，发现ARF1及其相关蛋白在囊泡出芽、运输和定位过程中高度富集，表明ARF1在线粒体释放中具有潜在功能。进一步IP实验分析，H图结果显示抑制LRP1星胶中的高乳酸化与ARF1的激活相偶联。

为了检测ARF1-Kla73是否是线粒体释放的关键介质，将ARF1的第73位赖氨酸突变为精氨酸（K73R），从而阻止了乳酸化修饰，I图中观察到在K73R转染的细胞中抑制ARF1活性并上调线粒体释放。相反，将K73突变为谷氨酰胺（K73Q），模拟乳糖基化，导致ARF1的激活，并进一步抑制线粒体的释放。这些发现表明乳酸通过ARF1 - Kla73减少星形胶质细胞线粒体的释放。

图4 ARF1 K73乳糖基化介导LRP1诱导的线粒体释放

接下来，作者试图检测LRP1诱导的线粒体转移是否对脑缺血损伤具有保护作用。作者用携带sh LRP1或空载的AAV2载体，在星形胶质细胞特异性Gfa ABC1D启动子的指导下，在C57BL/6J雄性小鼠的星形胶质细胞中敲低LRP1；通过A图的免疫荧光观察到特异性表达情况。与在培养的星形胶质细胞中观察到的结果一致，LRP1条件性敲除（cKD）的小鼠表现出B图中葡萄糖摄取增加和C图中脑中乳酸水平升高，这导致D图中脑脊液中星形胶质细胞线粒体减少。为了进一步研究星形胶质细胞线粒体，作者使用AAV2-Gfa ABC1D-Cre驱动的PhAMfloxed (光激活线粒体)标记Lrp1 条件敲除cKD小鼠星形胶质细胞线粒体。通过Z-stack共聚焦显微镜和活体双光子成像验证，E图显示LRP1敲低导致神经元中观察到的星形胶质细胞来源的线粒体减少。随后进行了大脑中动脉闭塞（MCAO）手术诱导大脑缺血再灌注损伤。术后，LRP1 cKD小鼠显示出F图中梗死面积的显著扩大，表明LRP1对大脑的缺血性损伤具有保护作用。以及G图中贝德森神经功能评分、水迷宫和矿场实验中cKD小鼠表现出更差的神经功能。在边界区域的神经元中，细胞内线粒体减少，特别是来自星胶的线粒体（图5H-J）。这一观察突出了星形胶质细胞在应激条件下维持大脑稳态的潜在作用。

图5 LRP1调控星形胶质细胞线粒体转移减轻脑缺血再灌注损伤

图6 星形胶质细胞ARF1-K73的乳糖化修饰降低了线粒体转运，加重了大脑的缺血再灌注损伤