铁死亡（Ferroptosis）是一种新的受调控细胞死亡形式，其特征是铁依赖性的脂质过氧化积累，涉及各种病理生理过程，包括癌症。靶向铁死亡是一种新的抗癌策略，鉴定FDA批准的药物作为铁死亡诱导剂被视为癌症治疗的新方法。尽管越来越多研究表明抗糖尿病药物二甲双胍作为抗癌剂的潜在有效性，但其确切的机制尚未完全阐明。
2021年6月23日，浙江大学附属邵逸夫医院周济春/王林波团队在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF：11.4）杂志上发表题目为“Metformin induces Ferroptosis by inhibiting UFMylation of SLC7A11 in breast cancer”的文章。通过免疫沉淀和免疫组织化学染色等技术，发现二甲双胍通过抑制SLC7A11的UFM修饰诱导铁死亡，增加细胞内Fe²⁺和脂质ROS水平，抑制肿瘤生长。体内实验验证了二甲双胍在裸鼠原位移植肿瘤模型中的效果。同时，二甲双胍与 SLC7A11抑制剂SAS协同作用，进一步增强铁死亡和抑制乳腺癌细胞增殖。该研究首次揭示了二甲双胍诱导铁死亡的新机制，并确定了SLC7A11作为UFM修饰的新底物，提出靶向UFM1/SLC7A11通路作为癌症治疗的新策略。
主要内容
越来越多的证据表明，二甲双胍在临床环境中具有预防和治疗乳腺癌的巨大潜力，并且二甲双胍能够有效抑制乳腺癌的增殖。作者的研究显示，二甲双胍能够以剂量和时间依赖的方式有效抑制某些乳腺癌细胞的增殖（图1A）。接下来，作者探讨了二甲双胍在乳腺癌细胞中的抗癌活性是否与这些已知的受调控细胞死亡形式相关。作者使用了多种细胞死亡抑制剂，包括Z-VAD-FMK（一种凋亡抑制剂）、necrosulfonamide（一种坏死性凋亡抑制剂）和3-甲基腺嘌呤（3-MA，一种自噬抑制剂）。由于已知二甲双胍能够调节细胞内铁稳态，这可能与细胞代谢有关，作者还引入了一种铁螯合剂，去铁胺（DFO）。结果显示，DFO与二甲双胍共同培养的T47D和MCF7细胞恢复了细胞活力（图1B）。在作者的研究中，Z-VAD-FMK、necrosulfonamide和3-MA与DMSO相比，也略微提高了细胞活力（图1B），并且DFO的效果远远显著于凋亡和自噬抑制剂（图1b）。此外，二甲双胍促进了铁离子的积累，DFO抑制了铁离子水平的增加（图1C和D）。碘化丙啶染色明确了DFO抑制了二甲双胍诱导的T47D细胞死亡（图1E）。综上结果，表明铁离子对于二甲双胍的抗癌效果是必需的，并且二甲双胍诱导的铁离子增加可能是其发挥抗癌作用的机制之一。
图1 DFO可抑制二甲双胍诱导的细胞死亡
为了明确二甲双胍与铁死亡之间的关系，作者首先研究了二甲双胍对铁死亡形态特征的影响。铁死亡的一个独特形态特征是线粒体体积减少和膜密度增加。透射电子显微镜显示，二甲双胍在MCF7和T47D细胞中诱导了线粒体体积减少和膜密度增加（图2A）。接下来，作者重点研究了二甲双胍对铁死亡生化过程的影响，包括总ROS和脂质过氧化物的积累（这些可以被铁死亡抑制剂DFO和Fer-1抑制）以及细胞内GSH水平的降低。因此作者用不同浓度的二甲双胍处理乳腺癌细胞，并使用相应的试剂盒检测这些指标。不出所料，结果显示，二甲双胍增加了细胞内总ROS和脂质ROS水平，并且脂质ROS的增加可以被铁死亡抑制剂（DFO和Fer-1）抑制，而DFO和Fer-1本身对这些指标几乎没有影响（图2B和C）。此外，二甲双胍降低了细胞内GSH水平（图2D）。此外，作者测试了铁死亡抑制剂（DFO和Fer-1）是否能够逆转二甲双胍的抗癌效果。结果显示，当T47D细胞用二甲双胍处理时，DFO和Fer-1均能显著恢复细胞活力（图2E）。此外，碘化丙啶染色确认了Fer-1抑制了二甲双胍诱导的T47D细胞死亡（图2F）。综上所述，二甲双胍可以诱导铁死亡。
图2 二甲双胍可诱导铁死亡
接下来，作者研究了二甲双胍如何诱导铁死亡。铁死亡由脂质过氧化触发，并且由半胱氨酸-谷氨酸逆向转运系统的关键组分SLC7A11严格调控。GPX4和GSH协同调节脂质过氧化。GSH的生成受SLC7A11调控，SLC7A11是谷氨酸转运系统中的关键因素，在铁死亡通路中起重要作用。为了确定二甲双胍调控铁死亡的具体分子机制，作者检测了不同浓度和处理时间的二甲双胍对SLC7A11和GPX4表达的影响。结果显示，二甲双胍在剂量和时间依赖性方式下有效抑制了T47D和MCF7细胞中SLC7A11的表达，而其转录水平显著升高（图3A和B）。此外，二甲双胍对GPX4表达没有显著影响（图3A）。为了进一步明确SLC7A11在二甲双胍抗癌作用中的作用，作者在T47D细胞中过表达SLC7A11，以检测二甲双胍敏感性及其对脂质ROS和GSH水平的影响，结果显示过表达SLC7A11显著逆转了二甲双胍的抗癌效果和GSH的上调（图3C和D）。这些结果表明，二甲双胍可以通过下调SLC7A11蛋白水平诱导铁死亡以抑制癌症。
图3 二甲双胍抑制SLC7A11的表达
UFM化是一种类似于泛素的修饰，在乳腺癌的发生和发展中起重要作用。UFM1系统在后生动物和植物中是保守的，但在酵母中不存在，这表明其在多细胞生物中具有特定的作用。基于DRUGSURV数据库分析（DRUGSURV：一种基于患者生存信息的已批准和实验性药物在肿瘤学中的再定位资源），作者发现UFM1可以间接地被二甲双胍靶向（图4A）。作者推测UFM1可能在二甲双胍的抗癌作用中起某种作用。为了检测二甲双胍对UFM1的调控作用，作者测试了二甲双胍对UFM1表达的影响。结果显示，二甲双胍在一定程度上抑制了UFM1蛋白和整体UFM化修饰水平（图4B），但不影响UFM1的转录水平（图4C）。为了进一步明确UFM1对二甲双胍抑制肿瘤活性的影响，作者在T47D细胞中过表达了UFM1。结果显示，过表达UFM1有效阻止了二甲双胍的抗癌作用，并恢复了二甲双胍介导的GSH水平的抑制（图4D和E）。综上所述，二甲双胍可能通过UFM1发挥其抗癌作用，UFM1可以调节GSH水平。
图4 二甲双胍可调控UFM1的表达
铁死亡由脂质过氧化触发，并由半胱氨酸-谷氨酸逆向转运系统的关键组分SLC7A11严格调控，因此，探索其调控机制有助于在癌症治疗中找到进一步诱导铁死亡的新治疗靶点。结果表明，铁死亡诱导剂erastin下调了UFM1和SLC7A11的表达，表明UFM1可能参与铁死亡调控。为了阐明UFM1在二甲双胍调控铁死亡中的作用，作者首先检测了不同乳腺癌细胞系中SLC7A11和UFM1的表达。结果显示，SLC7A11和UFM1蛋白水平之间存在明显的正相关性（图5A）。接下来，利用公开数据库，作者的生物信息学分析显示SLC7A11的表达与乳腺癌患者预后之间存在显著的负相关性，但UFM1则没有（图5B）。为了确定SLC7A11和UFM1是否具有调控作用，作者检测了敲低UFM1后SLC7A11的表达效果。结果显示，敲低UFM1下调了SLC7A11的表达，但不影响其转录水平（图5C）。此外，敲低UFM1降低了SLC7A11的蛋白稳定性（图5D）。为了确定SLC7A11是否可以被UFM1修饰，作者在敲低或未敲低UFM1的条件下检测了SLC7A11的UFM化。结果发现，SLC7A11是UFM化的底物，其修饰的特异性通过敲低UFM1得到确认（图5E）。UFM1与目标蛋白的共价结合可以被UfSP2酶逆转。进一步的UFM化修饰检测显示，SLC7A11的UFM化可以被UfSP2抑制（图5F）。这些发现将SLC7A11定义为UFM1的新修饰底物。此外，为了阐明二甲双胍调控SLC7A11的具体分子机制，作者使用二甲双胍处理的细胞检测了二甲双胍对SLC7A11 UFM化水平的影响。结果显示，二甲双胍有效抑制了SLC7A11的UFM化水平（图5G）。综上所述，二甲双胍通过抑制SLC7A11的UFM化来下调SLC7A11蛋白稳定性，从而诱导铁死亡。
图5 二甲双胍通过抑制SLC7A11的UFM化下调SLC7A11的表达
目前，许多研究已经表明，二甲双胍可以直接作用于肿瘤细胞，并通过AMPK依赖和/或AMPK非依赖的信号通路发挥其抗肿瘤生物学效应。作者的结果也显示，二甲双胍可以激活AMPK的磷酸化（图6A）。因此，为了确定AMPK通路是否参与了二甲双胍对铁死亡的调控，作者首先明确AMPK的激活是否可以诱导铁死亡。结果显示，AMPK激活剂AICAR增加了脂质ROS的生成并抑制了SLC7A11的表达，这表明AMPK的激活可以诱导铁死亡（图6E和F）。为了进一步确定AMPK通路在二甲双胍诱导的铁死亡中的作用，作者在有或没有AMPK抑制剂Compound C的条件下，用二甲双胍处理细胞。有趣的是，结果显示二甲双胍和Compound C的结合可以协同增加脂质ROS的水平，并抑制GSH的水平和SLC7A11的表达（图6A、B、C）。此外，Compound C本身可以增加脂质ROS和Fe²⁺的生成（图6C和D）。因此，这表明AMPK的平衡对于细胞生存至关重要，AMPK的激活或抑制可能会在细胞中引发应激反应，其中可能涉及铁死亡。总之，无论是二甲双胍还是AMPK失衡都可以诱导铁死亡，而二甲双胍可能在不涉及AMPK的情况下诱导铁死亡。
图6二甲双胍可独立于AMPK通路诱导铁死亡
基于之前的数据，作者探究使用SAS （sulfasalazin，一种SLC7A11抑制剂）是否会增强二甲双胍诱导的脂质过氧化和铁死亡，从而使癌细胞对二甲双胍更敏感。作者将细胞处理成二甲双胍与SLC7A11抑制剂 SAS的组合。随后，使用CCK8法检测细胞活力，以确定二甲双胍和 SAS组合的协同作用。结果显示， SAS与二甲双胍的组合可以以协同方式抑制乳腺癌细胞的增殖（图7A）。SAS与二甲双胍的组合诱导线粒体体积减少和膜密度增加（图7B）。进一步的脂质过氧化和GSH检测表明，二甲双胍和 SAS的组合显著增加了脂质ROS水平并抑制了GSH的生成（图7C和D）。DFO和Fer-1有效减弱了二甲双胍与 SAS组合的杀伤效果（图7E）。综合来看，作者的数据表明SAS与二甲双胍的组合协同诱导脂质过氧化和铁死亡，从而抑制乳腺癌的增殖。
图7 SAS和二甲双胍的协同作用可有效抑制乳腺癌
作者研究了在体内SAS是否会增强二甲双胍的抗癌活性。将T47D细胞皮下植入免疫缺陷裸鼠的右侧背部。一周后，携瘤小鼠被随机分为四组，随后分别用DMSO、二甲双胍、SAS或二甲双胍与SAS联合处理。结果显示，与DMSO组相比，二甲双胍和SAS显著抑制了肿瘤生长（图8A和B）。在四组中，二甲双胍与SAS联合组在抑制肿瘤生长方面效果最显著（图8A和B）。此外，接受二甲双胍和SAS处理的小鼠显示出更低的UFM1和SLC7A11表达以及更高的4-HNE表达，4-HNE常被用作组织中氧化应激的通用标志物（图8C）。这些数据表明，SAS使癌细胞对二甲双胍诱导的脂质过氧化和铁死亡更加敏感，从而在体内抑制肿瘤。
图8 在体内SAS协同增强二甲双胍的抗癌活性
研究总结
本研究首次建立了二甲双胍与铁死亡之间的联系，具体联系如下：SLC7A11可以被UFM1修饰；二甲双胍通过抑制SLC7A11的UFM化，下调SLC7A11蛋白稳定性，从而以AMPK非依赖的方式诱导铁死亡，发挥其抗癌作用。这些发现揭示了二甲双胍的抗癌新机制，为癌症治疗提供了新的思路。未来的工作将需要确定细胞对铁死亡的敏感性和耐受性的决定因素，以及这些反应与其他类型受调控细胞死亡之间的机制联系，将有助于进一步挖掘二甲双胍在不同遗传或肿瘤环境下的治疗效用，为癌症患者的临床治疗提供新的范例。
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