肝细胞癌（HCC）是世界许多地区癌症相关死亡的主要原因。肝切除术是非肝硬化肝细胞癌患者的一种治疗选择，可以进行大范围切除而没有危及生命的并发症。尽管近年来防治技术有所进步，但由于肝癌的诊断较晚、肿瘤复发等原因，其长期生存率仍然较低。一般来说，肝癌的治疗难度大，肝癌的防治形式严峻。开发治疗HCC的新药具有重要意义。中医药是恶性肿瘤综合治疗措施的重要组成部分, 具有“多成分、多靶点、多途径”的特点。利用网络药理学等生物信息学方法，提高药物发现效率，打破传统的“一药一靶一病”的思维模式和框架，是中医药发展的新模式，其药物发现对推动癌症治疗和精准医疗具有重要意义。
2023年2月9日，南京市第二医院杨永峰团队在杂志Frontiers in Pharmacology上发表题为“Study on the mechanism of action of Scutellaria barbata on hepatocellular carcinoma based on network pharmacology and Bioinformatics”的文章。该研究中，揭示了半枝莲治疗肝癌的作用机制可能是其有效成分抑制核心基因的表达，阻断PI3K-AKT信号通路，从而抑制癌细胞的增殖、迁移和诱导细胞凋亡。
https://www.frontiersin.org/jouRNAls/pharmacology/articles/10.3389/fphar.2022.1072547/full
主要内容
结果1：半枝莲活性成分及靶标筛选结果
根据口服生物利用度（OB）≥30%和类药（DL）≥0.18的标准，从TCMSP数据库中筛选出29种半枝莲活性成分（表1）。通过TCMSP数据库和瑞士靶标预测网络服务平台共收集了461个活性成分相关靶标。
以“肝细胞癌”和“HCC”为关键词，在TTD数据库中收集到53个靶点，在GeneCards数据库中收集了7917个靶点。在去除重复后，获得了8238个潜在的HCC治疗靶点。
表 1半枝莲的有效成分
结果2：半枝莲治疗肝癌的靶点研究
通过将活性成分的靶点与肝细胞癌的潜在治疗靶点进行交叉，共获得372个肝细胞癌潜在的治疗靶点。Cytoscape软件用于构建“中药成分-靶病”调控网络（图1）。控制网络有403个节点和2424条边。
图1 “中药-活性成分-靶点-疾病”监管网络
结果3：PPI网络构建及核心基因筛选与验证
将药物治疗疾病的潜在靶基因信息导入STRING在线平台（隐值为0的节点），结果导入Cytoscape3.9.0软件。全球的关键基因获得的MCC的算法“Cytohubba的插件(图2)。GEPIA数据库分析表明,关键基因的信使RNA表达水平CDK1, SRC,到,PCNA E2F1在肝细胞癌与正常肝组织相比均有显著调节(图3)。人类的蛋白质图谱(HPA)结果表明,到基因在肝癌组织中高度表达,CDK1, SRC,和适度CDK2基因在肝癌组织中表达,细胞核抗原,和RB1基因在肝癌组织中低表达，在正常肝组织中不表达，CCND1基因在肝癌组织和正常肝组织中高表达。
图2 药物-疾病交叉靶蛋白相互作用网络(A)和关键基因模块(B)
图3 通过GEPIA数据库验证肝癌和正常肝组织中关键基因的mRNA表达
E2F1基因在正常肝组织中中度表达，在肝癌组织中高度表达；CDKN1A和CDK6在肝癌组织和正常肝组织中均不表达（图4）。GEPIA生存分析结果显示，HCC中关键基因CDK1、CDK2、CDK4、E2F1和SRC的高表达与预后不良相关（Log-rank p < 0.05）（图5）。结合关键基因的验证结果，发现CDK1、SRC、CDK4和E2F1的mRNA和蛋白表达水平为与正常肝组织相比，HCC组织中表达过高，HCC患者中高表达与预后不良有关。这些结果表明，CDK1、SRC、CDK4和E2F1，在肝癌患者中高度表达，且与预后不良有关，极有可能是半枝莲治疗HCC的核心靶向基因。以上关键基因的表达对癌细胞的抑制作用已分别在先前的多项研究中得到证实。
图4 来自HPA数据库的HCC和非癌肝组织的代表性免疫组化图像
图5 LIHC患者中10个关键基因过表达的总生存时间
结果4：GO和KEGG富集分析结果
利用R软件的“ClusterProfiler”包对肝细胞癌药物治疗潜在靶点的基因信息进行GO和KEGG富集分析。共获得3056个氧化石墨烯富集条目，包括生物过程（BP, 2717）、细胞成分（CC, 91）和分子功能（MF, 248）。主要富集的生物过程包括对外源刺激的反应、伤口愈合、氧化应激的反应；主要富集的细胞成分为质膜筏、囊泡腔、细胞器外膜。主要富集的分子功能包括核受体活性、配体活化转录因子活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性等。KEGG通路分析富集到180个富集结果。KEGG通路富集分析结果显示，除多种肿瘤通路外，基因主要富集于PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、凋亡等通路。利用R语言软件分析，GO富集分析中生物过程、细胞组分和分子功能中p值最小的10条通路以及KEGG富集分析的p值最高（图6）。
PI3K-Akt信号通路在KEGG富集分析结果中起重要作用。PI3K-Akt信号通路与细胞增殖、细胞周期进展和细胞凋亡密切相关。抑制HCC进展是通过抑制PI3K-Akt信号通路实现的。结合网络药理学分析结果及前期研究推测，半枝莲可能通过枸杞苷、hispidulin、eriodictyol等活性成分阻断PI3K-Akt信号通路，抑制癌细胞的增殖和迁移，诱导癌细胞凋亡，起到治疗肝癌的作用。
结合网络药理学分析结果及前期研究推测，半枝莲可能通过枸杞苷、hispidulin、hriodictyol等活性成分阻断PI3K-Akt信号通路，抑制癌细胞的增殖和迁移，诱导癌细胞凋亡，起到治疗肝癌的作用。
图6 GO富集分析和KEGG富集分析
结果5：药物相似度及ADME特征分析
研究者根据TCMSP数据库“相关靶标”部分“靶标信息”中的“成分-靶标”相互作用信息，在五香中发现1种与CDK1、SRC、E2F1相互作用的成分，9种与CDK1、SRC相互作用的成分，1种与CDK4、CDK1相互作用的成分。有五种成分仅与SRC相互作用，一种成分仅与CDK1相互作用。半枝莲中与核心基因靶点相互作用的成分有17种。使用瑞士ADME网络服务平台筛选符合Lipinski五项规则且未穿透血脑屏障的12个化合物（表2）。
利用AutoDock Vina软件进行核心基因靶蛋白的分子对接和中药成分的相互作用。一般认为配体与受体的结合能越低，结合力越好。当结合能小于0 kcal/mol时，两者可以自发结合。当结合能小于−5 kcal/mol时，结合力较好。当结合能小于−7 kcal/mol时，结合构型具有较强的活性。根据分子对接结果，所有核心活性成分与核心靶蛋白的结合能均≤- 5 kcal/mol（表3）。将Vina评分最低的前6个化合物的对接模式可视化（图7）。
表2 核心活性成分的ADME特性
结果6：鼠李糖苷和木犀草素抑制HepG2细胞和Hep3B细胞的增殖
在本研究中，加入不同浓度的药物治疗HepG2细胞和Hep3B细胞后，使用CCK-8试剂盒检测细胞活性。实验结果显示，特定浓度的鼠李糖苷和木犀草素能够抑制HepG2细胞和Hep3B细胞的增殖（图8）。
既往研究表明，抑制核心靶基因的表达可以抑制癌细胞的增殖，诱导癌细胞凋亡。根据生存分析结果，这些基因在肝细胞癌中的高表达与预后不良有关。上述核心靶点及其相应活性成分的分子对接结果显示出良好的活性构型。结合以往对核心基因在癌症发生发展中的作用及活性成分药理作用的研究，推测半枝莲治疗肝细胞癌的机制可能是通过鼠李糖苷、Hispidulin等。半枝莲素等活性成分抑制核心基因的表达，调节细胞周期，抑制癌细胞的增殖和迁移，诱导细胞凋亡。
表3 分子对接能量
图7 Vina评分最低的前六种化合物的分子对接模式
图8 鼠李素和木犀草素抑制细胞活力
结论
本研究结合半枝莲在临床中的实际应用，采用网络药理学方法和分子对接技术，按照口服类药规律分析其有效成分治疗肝癌的作用机制，揭示了半枝莲治疗肝癌的作用机制可能是其有效成分抑制核心基因的表达，阻断PI3K-AKT信号通路，从而抑制癌细胞的增殖、迁移和诱导细胞凋亡。这为探索半枝莲治疗肝癌的有效成分开发进行了初步的理论研究。我们期望为临床治疗肝细胞癌提供更多的选择。
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