细胞焦亡（pyroptosis）是近年来发现并证实的一种新型细胞程序性死亡方式，其特征为依赖于炎性半胱天冬酶（主要是caspase-1，4，5，11），并伴有大量促炎症因子的释放。细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展，并发挥重要作用。随着研究的深入，人们对细胞焦亡调节机制的理解也更加深刻。今天为大家介绍的这篇邵峰和刘小云团队发表在nature上的文章讲述了志贺菌逃避细胞焦亡的一种新型的翻译后修饰，极具开创性，堪称是一项里程碑式的工作！
北京生命科学研究所邵峰实验室和北京大学基础医学院刘小云实验室在Nature上合作发表了题为“Shigella evades pyroptosis by arginine ADP-riboxanation of caspase-11“的研究成果。该研究发现福氏志贺菌（Shigella flexneri）通过分泌效应蛋白OspC3介导一种全新的翻译后修饰(精氨酸ADP-riboxanation)来抑制caspase-4/11的功能，避免宿主细胞焦亡的发生，从而逃避了机体免疫系统对细菌的识别和清除。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-021-04020-1
摘要
邵峰院士此前的工作就已经发现，病原菌（尤其是革兰氏阴性细菌）侵入细胞后，宿主细胞内的胱天蛋白酶（caspase家族蛋白酶）会被细菌膜上的关键成分脂多糖（LPS，俗称内毒素）激活，然后切割关键蛋白GSDMD，使之在细胞膜上打孔，最终诱导细胞焦亡，使宿主抵抗病原菌的侵入。志贺氏菌属（Shigella，又称痢疾杆菌），作为一种革兰氏阴性菌，侵入宿主细胞后，能够迅速逃避细胞焦亡的清除并在胞质内自由地生长繁殖。我们不免发问，志贺菌是如何逃避了caspase-4/11介导的细胞焦亡呢？
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志贺菌通过分泌OspC3来
抑制LPS诱导的细胞焦亡
邵峰实验室的研究人员首先发现，在给小鼠感染伯克霍尔德菌（革兰阴性菌）时，野生型小鼠能够存活下来，但Casp11敲除的小鼠很快就死亡了，确认了caspase-11对于抵抗革兰氏阴性菌的重要作用。然而，在志贺菌感染时，两种小鼠却没有表现出明显差异。作者在体外细胞感染模型也发现，伯克霍尔德菌和沙门氏菌 （均为胞内革兰氏阴性菌）可以显著性导致caspase-4/11介导的细胞焦亡的激活，然而志贺菌并不能激活细胞焦亡。这表明志贺菌可能通过某种方式抑制了caspase-4/11–GSDMD通路的激活，进而逃避了细胞焦亡的清除。
在13年就有研究表明，志贺菌可通过其三型分泌系统释放一些效应蛋白调节宿主细胞的多种信号通路。因此作者就对这些效应蛋白作了进一步研究，发现敲除了OspC3的志贺菌可显著诱导caspase-4/11依赖的GSDMD的切割以及细胞焦亡的发生，这就表明了志贺菌可能通过分泌OspC3来抑制LPS诱导的细胞焦亡。
Fig1| (a) 腹腔注射伯克霍尔德菌和志贺菌后小鼠生存曲线；（c）敲除了OspC3的志贺菌对细胞焦亡的作用。
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OspC3催化caspase-4/11的
那么志贺菌是如何通过OspC3达到抑制细胞焦亡的作用呢？研究发现，在宿主细胞中过表达OspC3便能够抑制LPS诱导的GSDMD的切割以及细胞焦亡的发生，这表明志贺菌的感染是通过分泌OspC3进而抑制了caspase-4/11的活性。随着进一步的研究，作者发现OspC3与caspase-4/11会发生相互作用。然而，作者发现如果将重组表达的OspC3与caspase-4/11在体外进行孵育时，OspC3并不能抑制caspase-4/11对GSDMD的切割，但如果将同样的OspC3蛋白转入细胞，LPS诱导的焦亡却能够被抑制。这也就表明OspC3不只是简单地通过相互作用来抑制caspase-4/11的活性，而是需要细胞内某种成分的参与才能发挥作用。
而且作者注意到，在SDS-PAGE凝胶上，与OspC3共表达的caspase-4迁移速率变慢，非变性胶上也可观察到条带位置发生显著变化，这一数据表明，与OspC3共表达后，caspase-4/11蛋白上很可能发生了某种翻译后修饰。通过进一步的质谱分析，作者发现这种修饰使得caspase-4/11蛋白的分子量增加了524Da，然而目前存在的各种修饰类型中并没有与之对应的修饰可以增加524Da的分子量。这一意料之外的结果引起了作者的兴趣，这也许意味着一种新的修饰类型的诞生。随着进一步的分析，作者猜想这可能是与ADP-核糖基化相关的一种翻译后修饰。在这种修饰中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）作为供体，其中的ADP-核糖（ADPR）基团被转移到氨基酸残基的侧链上，使其分子量增加541Da。作者发现，在NAD+存在的情况下，纯化的OspC3蛋白也可以在体外重组反应中实现对caspase-4/11的修饰，这证明OspC3就是直接催化该翻译后修饰的酶，并且这种修饰的供体也是NAD+。但如果真是如此，那么减少的17Da又是由于何种原因呢？
Fig2| (b-c) 在293T细胞中探究OspC3与caspase4/11的相互作用以及OspC3对caspase4/11的修饰；（d）NAD+对OspC3影响的电喷雾电离质谱和碰撞诱导解离质谱分析
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OspC3催化caspase-4/11中
接下来，作者通过电子转移/高能碰撞解离质谱（EThcD-MS）分析发现，这个524Da的修饰分别发生在caspase-4 第314位或caspase-11第310位的精氨酸残基上 （R314/R310），如果将R314/R310位点突变为赖氨酸或天冬酰胺后，该修饰不再发生。研究至此，作者接下来便开始研究NAD+作为供体以何种方式在精氨酸残基加上524 Da的修饰。
与已知的ADP-核糖基化的过程一致，作者通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析证明，NAD+中的ADP-核糖基团被转移到了底物蛋白上，同时释放了烟酰胺。那么，和之前的疑问一样，如何解释减小的17 Da？作者团队分析，仅从分子量上分析，减小17 Da很可能是由于发生了脱氨反应，而可能的脱氨位点只有两个：腺苷上的氨基和精氨酸侧链的氨基。
根据上面的假设，作者首先检测了修饰反应后的产物，发现的确有氨的产生。接下来，作者又利用焦磷酸键水解酶NUDT16与修饰后的caspase-4反应，发现成功地从修饰中去除了一个完整的AMP基团，表明在该修饰中AMP是作为一个整部分保持不变的，这也表明脱去的氨基很大概率是精氨酸侧链的氨基。进一步的侧面实验也证明，通过已经脱氨的NAD+（Deamino-NAD+）进行修饰反应时，从分子量变化分析也存在脱氨反应。接下来，作者利用稳定同位素氨基酸标记 （SILAC）结合质谱分析的方法，发现修饰后的精氨酸残基存在氮原子（N）丢失的现象，这也为精氨酸残基上发生的脱氨反应找到了直接证据。由此，作者证明了OspC3介导的修饰反应实质上由精氨酸残基的ADP-核糖基化和脱氨组合而成（+541-17=524 Da）。作者接下来又通过一系列生化实验和多种分析推理论证，最终发现OspC3通过催化两步亲核取代反应，实现利用NAD+对caspase-4/11-R314/R310的共价修饰。作者将这种全新的修饰命名为ADP-riboxanation，并据此将OspC3的活性定义为精氨酸ADP-riboxanase。
Fig3| (a)在细菌中ospc3修饰的caspase-4-p30-C/A中含有Arg314的肽段的EThcD串联质谱;（c）NAD+类似物对OspC3修饰的caspase-4-p30的质量变化;(g) ADP-riboxanated和ADP核糖基化修饰的化学结构图。
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OspC家族和caspase-4/11的OspC3失活机制
那么，ADP-riboxanation这种修饰导致caspase-4/11失活的机制是什么呢？在caspase-4/11水平上，作者发现，OspC3既能阻断caspase-4/11的自切割，也可以对已经活化的caspase-4/11进行修饰，从而既能抑制caspase-4的活性又能阻断与GSDMD的相互作用。由于修饰后的caspase-4/11失去了结合和切割GSDMD的能力，同时也失去了切割其最适多肽底物的能力，便导致了细胞焦亡的抑制。后续作者又通过对caspase家族的蛋白序列进行比对分析，发现修饰发生的精氨酸位点在所有caspase家族成员中都是保守的，将caspase-4/11 的 R314/310突变为赖氨酸、丙氨酸或谷氨酸均可使其失活。因此，R314/310 ADP-riboxanation破坏了caspase-4/11蛋白酶关键位点的生化特性，使它们丧失了基本的切割多肽的功能。
在OspC蛋白水平上，OspC又是如何识别并修饰caspase-4/11呢？根据当前人们对福氏志贺菌的研究，其一共编码三个OspC家族蛋白：OspC1、OspC2和OspC3。尽管这三个蛋白的序列一致性较高，但与OspC3不同的是，OspC1/2几乎不修饰caspase-4，也不能抑制LPS诱导的细胞焦亡。基于序列分析的结构预测表明它们均包含一个位于C端的ankyrin repeats domain（ARD，介导蛋白质间的相互作用）和一个未知功能的N端结构域。通过进一步的诸多实验，作者最终证明了，OspC3的ARD，而非OspC1/2的ARD，能够与caspase-4发生相互作用。
Fig4|（a）OspC3的结构域示意图；（c）在293T细胞中，caspase-4-p30-C/A与OspC的ARD共免疫沉淀；（d）OspC3 (WT或D177A)体外修饰的Caspase-4-p30-C/A
最后，作者发现在野生型志贺菌致死剂量的感染条件下，野生型小鼠在感染OspC3活性缺失的菌株后可以存活。然而，Casp11敲除小鼠对野生型和ospC3敲除的菌株同样敏感。这些结果表明Ospc3介导的caspase-11的失活在志贺菌逃逸宿主免疫防御中具有关键作用。并且作者还发现了caspase-11介导的细胞焦亡对激活适应性免疫也起一定作用。综合以上结果，作者发现OspC3的敲除可以作为一种潜在的志贺菌减毒活疫苗的开发策略。而经过研究发现OspC家族蛋白在多种细菌中存在，这就表明ADP-riboxanation修饰可能普遍存在细菌感染性疾病中。
Fig5|（a）WT和Casp11−/−小鼠腹腔内感染志贺菌WT或ospC3缺失/互补菌株后小鼠生存曲线。
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研究总结
结合以上所述，该研究发现了志贺菌逃避细胞焦亡的一种新型的翻译后修饰——精氨酸ADP-riboxanation。志贺菌通过效应蛋白OspC3对caspase-4/11进行修饰，抑制了caspase-4/11的激活及其对GSDMD的切割，抑制了LPS诱导的细胞焦亡，从而逃逸了caspase-4/11–GSDMD所介导的宿主抗胞内革兰氏阴性菌的免疫机制。此项研究不仅解开了病原菌志贺菌如何逃逸天然免疫之谜，也开辟了蛋白质翻译后修饰领域一个全新的篇章，为今后革兰阴性菌感染相关疾病的研究和治疗无疑提供了一个开创性的思路，这也堪称邵峰团队在宿主和病原菌相互作用领域又一里程碑式的工作。
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