国自然热点：天津总医院+北京大学合作揭示脱氧胆酸介导的铁死亡加剧小鼠结肠炎机制

2024年4月18日，天津总医院曹海龙团队与北京大学姜长涛团队合作在Molecular Metabolism杂志上发表了题为“Microbial metabolite deoxycholic acid-mediated ferroptosis exacerbates high-fat diet-induced colonic inflammation”的研究，其发现高脂饮食可增加肠道菌群代谢物脱氧胆酸（DCA），从而诱导肠上皮细胞铁死亡，恶化小鼠结肠炎，为UC中与饮食相关的胆酸失调提供了新的见解。

研究者将小鼠在高脂饮食和标准饮食下分别喂养三周，并在最后一周使用2%葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导结肠炎。与CD组相比，HFD高脂饮食组的小鼠体重明显增加（图1B）。从体重指数、疾病活动指数、HE染色结果可以看出，与CD对照组相比，DSS诱导的小鼠体重减轻，疾病活动指数（DAI）升高，组织学损伤严重（图1B-E），证明了结肠炎动物模型的已经成功建立。同样，从这些结果中也发现，与 CD + DSS 组相比，HFD + DSS 组的体重减轻（图1B）、DAI 更高（图1C）、结肠长度更短（图1D），表现出更严重的结肠炎症和肠道屏障损伤。这些结果表明，DSS有效地建立了肠道炎症模型，而HFD处理显著加剧了DSS诱导的结肠炎症。另外研究者对小鼠粪便和血清中总胆汁酸和DCA的水平，结果发现，HFD 组和 HFD+DSS 组的粪便以及血清中总胆汁酸和DCA 水平高于对照组（图1F-I），这表明HFD大幅促进了DCA的产生。

那么DCA对结肠炎症有什么影响呢？为了解答这一问题，研究者建立了由DSS和TNBS诱导结肠炎模型。DSS诱导的结肠炎模型，用含2%DSS的饮用水喂养小鼠7 d，每日使用DCA灌肠，然后在第6天进行内窥镜检查，并在第7天处死小鼠（图1J）。

从小鼠内窥镜检查图像可以看出，对照组和DCA组小鼠血管形态正常，黏膜光滑透明，在DSS组患有结肠炎的小鼠中，肠壁增厚，粘膜透明度降低和结肠充血。与DSS组相比，DSS+DCA组小鼠黏膜透明度增强，结肠充血更明显，肠道出血明显，肠道损伤更严重（图1K）。体重变化结果显示，与对照组相比，DSS组小鼠体重明显减轻，与DSS组相比，DSS和DCA组小鼠体重减轻更加明显（图1L）。另外，DSS组和DSS+DCA组的DAI评分高于对照组，DSS+DCA组的DAI评分更高（图1M）。

在TNBS诱导的肠炎模型中，小鼠在第1天用2.5%TNBS或50%乙醇处理，第2-4天用DCA灌肠，分为DCA处理组和对照组，在第4天处死小鼠。对不同组的小鼠结肠长度进行比对，与DSS组相比，DSS + DCA组小鼠的结肠长度显着减少，TNBS + DCA组的小鼠比TNBS组的小鼠结肠长度更短从（图1N、R）。代表性H&E染色小鼠结肠横截面结果显示，DSS+DCA组和TNBS+DCA组表现出更严重的结肠炎症和肠道屏障损伤，导致结肠病理组织得分高于DSS组和TNBS组（图1O、P；图1S、T）。这些发现表明，高脂饮食HFD促进了DCA的产生，DCA加剧了DSS和TNBS诱导的结肠炎小鼠肠道屏障完整性的损害，表现出更严重的体重减轻、疾病活动指数（DAI）增加和结肠长度缩短，结肠炎症更加严重。

为了研究 DCA 加重肠炎的具体机制，研究者对DSS和DSS + DCA组的小鼠获得的结肠组织进行了 RNA 测序。转录组分析显示，结肠炎小鼠DCA治疗后，铁死亡相关基因的mRNA水平发生显著改变。经初步筛选，共鉴定出1174个基因为差异表达基因。与DSS组相比，DCA+DSS组上调808个基因，下调366个基因。KEGG亚类分析表明，DCA处理后差异表达基因主要参与细胞生长和死亡、膜转运和脂质代谢（图2A）。KEGG通路分析显示，DCA可以调节矿物质吸收、胆汁分泌和铁死亡信号通路（图2B）。基因集富集分析（GESA）表明，DCA促进了与铁死亡激活相关的结肠炎（图2C）。

铁离子积累和活性氧（ROS）生成增加是铁死亡的关键特征。接着研究者检测了铁死亡相关标志物及细胞形态的变化。透射电子显微镜（TEM）显示，用DSS处理后，肠上皮细胞发生了明显的线粒体缩小、膜增厚、线粒体嵴减少等铁死亡相关形态变化，而DCA处理加重了DSS诱导的肠上皮细胞线粒体损伤（图2D）。谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）的下调和酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员4（ACSL4）的mRNA 升高是铁死亡的关键特征。免疫组织化学染色结果显示，DSS组GPX4表达下调，ACSL4表达上调，DCA处理进一步加剧了DSS诱导的GPX4下调和ACSL4上调（图2D）。

研究者还测试了结肠炎模型中GPX4和ACSL4的mRNA水平。在DSS诱导的结肠炎小鼠中，检测到了GPX4在mRNA水平低表达而ACSL4高度表达，当DCA处理时，进一步抑制了DSS小鼠中GPX4 mRNA的表达，增加了ACSL4 mRNA的表达结果（图2E）。并且在TNBS小鼠中，GPX4和ACSL4的mRNA表达水平表现出相似的趋势（图2I）。接着研究者对了结肠炎模型小鼠的铁水平进行了测定，结果发现，DSS组和TNBS组的亚铁水平均有所升高，并且，DCA加剧了DSS诱导的结肠炎和TNBS诱导的结肠炎小鼠中总铁和亚铁离子水平的升高（图2F-J）。并且还发现，DSS和TNBS均能降低谷胱甘肽GSH水平，促进丙二醛（MDA）的产生，DCA处理加剧了GSH的消耗和MDA的积累（图2G、H）。

综上所述，可以推断出DCA促进了DSS和TNBS诱导的小鼠铁死亡，并加剧了小鼠的结肠炎症。

图2

紧接着为了证实DCA对肠上皮细胞铁死亡的影响，研究者接下来在体外探究了DCA是否影响肠上皮铁死亡。

在脂多糖（LPS）联合处理下，在IEC-6细胞和Caco-2细胞中均观察到铁死亡关键基因GPX4的mRNA水平下降，ACSL4的mRNA水平升高（图3A、B），WB实验中也观察到GPX4的蛋白表达水平降低而ACSL4的蛋白表达升高（图3C）。透射电子显微镜显示，LPS 处理后 IEC-6 细胞存在明显的线粒体缩小、膜增厚等铁死亡相关形态变化，DCA 处理进一步加剧了 LPS 诱导的 IEC-6 细胞线粒体损伤（图3D）。亚铁离子的荧光染色显示，LPS处理后亚铁离子（红色荧光）增加，在LPS的基础上用DCA处理后，亚铁离子红色荧光进一步增强（图3D）。

研究者在体外试验中进一步测量了相关数据，结果所示，DCA升高了用LPS处理的肠上皮细胞中亚铁离子水平，GSH的存在对于预防铁死亡至关重要，但在LPS和DCA治疗下，增加了GSH消耗（图3E、F）。DCA有效增加了用LPS处理的肠上皮细胞中ROS和脂质过氧化副产物MDA的水平（图3G、H）。为了进一步探究DCA对肠上皮细胞铁死亡，用FER-1铁死亡抑制剂处理肠上皮细胞，结果表明，铁死亡抑制剂Ferrostatin-1有效增加了GSH水平、降低了DCA诱导的MDA积累（图3I-K）。体外研究结果表明，DCA显著增强了LPS诱导的肠上皮细胞铁死亡，这可以被铁死亡抑制剂抵消。综上所述，DCA主要通过促进亚铁离子积累和脂质过氧化来加速肠上皮铁死亡。

图3

从前面的体内外实验表明，HFD增加DCA的含量，DCA可以促进铁死亡的发生，加剧结肠炎。接下来探究了DCA对铁死亡的调控机制。

单细胞火山图和热图结果显示，一种与铁死亡敏感性相关的基因SLC11A2（DMT1），在DSS组和DSS+DCA组均表现出差异表达（图4A、B）。通过FPKM测量转录组中基因的相对表达水平发现，DSS+DCA组DMT1的FPKM表达量高于DSS组（图4C）。

有研究表明，DMT1是HIF-2α的直接靶基因之一，肠道铁的吸收主要受 HIF-2α的调节，那么结合以上分析，研究者猜测DCA可能通过作用于 HIF-2α ，从而来上调 DMT1，进而通过激活HIF-2α/DMT1信号通路来加剧结肠炎。

因此，研究者从体内外模型中检测了不同组小鼠中HIF-2α、DMT1的水平。在体内，DSS处理后，HIF-2α和铁死亡敏感基因DMT1的mRNA表达显著上调，DSS和DCA联合处理进一步增强了他们的mRNA表达（图4D）。另外组织学分析进一步证实了这个结果，DSS处理强烈诱导HIF-2α和DMT1表达，在DCA和DSS处理的小鼠结肠中HIF-2α和DMT1表达显著增强（图4E）。

体外实验的定量结果显示，在培养的 IEC-6 细胞中，LPS 处理后 HIF-2α 和 DMT1 mRNA 的表达显着上调，与 LPS 和 DCA 共同处理后进一步增强了mRNA的表达（图4F）。WB实验结果也发现，LSP处理后， HIF-2α 和 DMT1 蛋白表达水平也显着上调，与 LPS 和 DCA 共同处理后进一步增强了蛋白表达水平（图4H）。另外，LPS上调了Caco-2细胞中HIF-2α和DMT1的mRNA水平，DCA和LPS的共处理显著增强了这种上调。

上述结果表明，DCA在体内和体外均有效触发HIF-2α/DMT1信号转导。这些结果表明，HIF-2α/DMT1通路的激活可能是DCA诱导的铁死亡的关键机制。

图4

前面的研究猜测，HIF-2α/DMT1通路的激活可能是DCA诱导的铁死亡的关键机制。接着研究者通过使用HIF-2α抑制剂和肠道特异性HIF-2α敲除小鼠分别在体外和体内两方面探究HIF-2α在DCA诱导铁死亡中的影响。

当用HIF-2α抑制剂PT2385处理IEC-6细胞时，PT2385 大幅阻断了 DCA 诱导的 HIF-2α 及其靶基因 DMT1 在肠上皮细胞中 mRNA 的表达（图5A）。WB实验进一步证明，在用PT2385处理后，DCA 诱导的 HIF-2α 及其靶基因 DMT1 在肠上皮细胞中蛋白表达明显下降（图5B）。另外在caco-2细胞中，用PT2385处理后，GPX4的mRNA的表达量增加，但是在IEC-6细胞中没有发现相应的变化（图5C）。

研究者还测了PT2385处理后，IEC-6、caco-2细胞中亚铁离子水平、谷胱甘肽GHS、ROS及MDA的含量，结果发现，DCA 增加了 LPS 处理的肠细胞中亚铁离子水平，增加了GSH的消耗，增加了 ROS 和 MDA 积累，而 PT2385 处理显著降低了细胞中亚铁离子水平，增加了GHS的消耗、降低了ROS和MDA的积累（图5D-G）。

另外研究者获得了肠道特异性HIF-2α敲除小鼠，从体内探究HIF-2α在DCA诱导铁死亡中的影响。研究者用DSS、DCA给药HIF-2αfl/fl小鼠和HIF-2αΔIEC小鼠，获得了DSS+HIF-2αfl/fl小鼠、DSS+DCA+HIF-2αfl/fl小鼠、DSS+HIF-2αΔIEC小鼠以及DSS+DCA+HIF-2αΔIEC小鼠。结果看出，DCA使患有结肠炎的HIF-2α小鼠的体重减轻，但对HIF-2αΔIEC小鼠没有任何改变（图5H）。结果显示，与 HIF-2α fl/fl结肠炎小鼠相比，DSS + DCA+HIF-2α fl/fl小鼠DAI 评分增加，结肠长度减（图5I、J）。DSS诱导的HIF-2αΔIEC小鼠的DAI评分低于对照组，结肠缩短的现象有所改善，但不显著。而与HIF-2α fl/fl+DSS+DCA相比，HIF-2αΔIEC+DSS+DCA小鼠的DAI评分显著降低，结肠缩短现象显著减少（图5I、J）。从病理表现上看，HIF-2α在肠道中的特异性缺失可以有效缓解DCA加重的肠道炎症。

接下来研究者检测了铁死亡标志物的水平。定量分析显示，HIF-2αΔIEC+DSS+DCA组GPX4的mRNA水平高于HIF-2α fl/fl+DSS+DCA组，ACSL4的mRNA水平降低（图5K）。HIF-2αΔIEC+DSS+DCA与HIF-2α fl/fl+DSS+DCA组相比，显著降低了亚铁离子水平，增加了GSH的消耗，降低了MDA的积累（图5L-N）。但是这些标志物的水平变化和HIF-2αΔIEC+DSS组没有显著差别。因此，肠道中HIF-2α缺乏有效地减弱了DCA诱导的肠道铁死亡，而对DSS诱导的铁死亡没有明显的阻断影响。综上所述，抑制HIF-2α在体内和体外均能有效抑制DCA诱导的铁死亡，DCA通过HIF-2α依赖性机制促进了铁死亡，加剧了结肠炎症。

图5

上述研究发现，抑制HIF-2α可以减轻DCA诱导的肠上皮铁死亡，那么进一步研究是否存在能够与HIF-2α相互作用，并影响其活性的中药小分子十分有意义。通过筛选中医（TCM）数据库，发现 HIF-2α 和 天然药物白芷素BKG 之间的对接评分显着升高。采用分子对接技术研究了中药单体BKG与HIF-2α蛋白之间的相互作用，发现BKG可以与HIF-2α蛋白的Asp251和MET-250氨基酸残基形成氢键相互作用（图6A、B）。这表明BKG与HIF-2α蛋白之间存在特定的空间构象。

随后研究者探究了BKG在DCA诱导的铁死亡和结肠炎症中的潜在作用。研究者构建了DSS诱导的结肠炎小鼠模型，给予小鼠DCA、BKG或DCA+BKG处理。随后对小鼠相关指标进行测定，结果发现，DSS+DCA组小鼠表现出体重减轻、DAI评分增加、结肠缩短的现象，而DCA+BKG共处理组改善了这些现象，表现为体重增加、DAI评分降低、结肠长度增加（图6D-F）。

另外，组织学分析进一步证实了 BKG 对 DCA 加重结肠炎的改善作用（图6G）。并且，DCA降低了结肠炎小鼠MUC2、ZO-1和occludin的mRNA表达，增加了促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达，而BKG可以逆转这些mRNA表达（图6H）。从这些结果来看，BKG可以有效逆转DCA加重的肠道炎症

DCA通过HIF-2α依赖性机制促进了铁死亡，加剧了结肠炎症，研究者通过蛋白质印迹分析，研究BKG对HIF-2α蛋白活性的影响。DSS组与DSS+BKG组HIF-2α蛋白水平差异无统计学意义，BKG对HIF-2α表达无影响（图6I）。然而，BKG似乎抑制了DCA诱导的HIF-2α的上调。接下来研究者探究了BKG对DCA诱导的肠道铁死亡的影响。免疫组化染色和qPCR分析结果发现，DCA和DSS处理可抑制GPX4表达，增强ACSL4表达，BKG处理增强了GPX4的表达，降低了ACSL4 mRNA的表达。并且，DCA和DSS的联合作用显著增强了总铁离子和亚铁离子水平、GSH消耗量和MDA积累量的增加，而在BKG处理后，有效抵消了这些影响（图6J、K）。综上所述，BKG通过阻断DCA上调HIF-2α，抑制DCA介导的肠上皮铁死亡，改善DCA诱导的小鼠结肠炎。

图6

为了进一步探讨 HFD 对活动性 UC 患者的影响，研究者分析了膳食脂肪摄入量与其临床生化参数之间的相关性（图7A）。临床研究发现，高脂饮食摄入与活动性UC患者的疾病活动指数、粪钙卫蛋白和红细胞沉降率呈正相关（图7B-D）。活动性UC患者和高脂饮食摄入UC患者的结肠镜检查图像结果显示，HFD患者表现出更严重的肠道病变，表明HFD加剧了结肠炎的临床表现（图7E）。

免疫组织化学分析显示，高脂饮食组UC患者的HIF-2α和DMT1表达增加，GPX4表达减少（图7E-H），表明铁死亡在高脂饮食组UC患者中更加显著。

图7