今天的思路是广州中山大学癌症中心发表于Nature Cell Biology上题为“5-methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs”。
这篇文章主要揭示了一种新的m5C RNA修饰调控膀胱癌癌基因的激活机制，为这种癌症及其他癌症提供潜在的治疗分子策略。
作为重要的mRNA修饰，与m6A修饰类似，m5C在多种生物发育调控过程发挥重要作用，但是由于目前的技术所限，对于m5C的修饰的生物学意义研究仍然有许多机理尚不清楚。前期的研究表明，NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族2 （NSUN2）负责对mRNA、rRNA和tRNA进行m5C修饰。这种修饰主要发生在翻录起始位点、3’UTR区和靠近Argonaute结合区域。近年来的报道也发现Aly/REF外运因子(ALYREF)作为mRNA m5C结合蛋白（阅读蛋白）协助m5C修饰mRNA从细胞核运输至细胞质过程。人类膀胱尿道上皮癌(UCB)包括两个主要的临床病理组别：非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC；pTA/1）和肌层浸润性膀胱癌（MIBC;pT2-pT4）。本文通过对人UCB的m5C测序揭露NSUN2和YBX1作为m5C的writer和reader，通过对发夹mRNA结合生长因子HDGF的3’UTR修饰促进UCB癌症的发生。
通过RNA-BisSeq测序发现，超过50个代表性的基因参与6条经典的癌症相关通路（JAK-STAT, ERBB, PI3K-AKT, VEGF, EMT和ERK-MAPK）。通过检测36个UCB样本和临近组织样本，包括22组膀胱癌和非膀胱癌样本获得他们的m5C超甲基化情况。通过检测发现，在肿瘤样品和正常细胞样品中，重要的癌症相关通路基因的m5C水平都有不同程度的增加。在NMIBC和MIBC不同癌症组别，发现MIBC组的这些癌症相关通路基因的m5C显著高于NMIBC。出现淋巴结转移的癌症比尚未出现淋巴结转移的癌症组别的癌症通路相关重要基因m5C水平要显著性提高。
为了研究m5C修饰与基因表达的关系，作者对UCB进行RNA-seq和并确定不同表达的mRNA与UCB的m5C位点高甲基化呈正相关。致癌基因HDGF，F11受体F11RRAB11家族互作蛋白4RAB11FIP4和MLLT11都有m5C高甲基化和mRNA表达量上调。在这22个配对的UCB和正常组织中得到验证他们的高表达水平与生存率DFS降低成正相关。这些数据表明m5C修饰可以提高这些鱼UCB进展相关的肿瘤基因mRNA表达。
前人研究表明，ALYREF是m5C细胞核阅读器。作者利用寡聚物pulldown实验，寻找互作的m5C阅读器。利用等温滴定方法确定YBX1的CSD（残基48-159）与m5C-modifiled RNA oligo结合。作者解析了静电电位YBX1 CSD-m5CRNA复合物结构。对RNA探针和m5C RNA探针修饰的ITC实验发现YBX1结合m5C探针的亲和力大于无m5C修饰的RNA探针。在NSUN2下调表达的Hela细胞系和T24细胞系中，被pulldown下来的YBX1明显减少。这些结果说明，YBX1是一个新的m5C阅读器。
为了探索YBX1是如何介导UCB的RNA代谢的，作者通过在人T24细胞筛选了YBX1互作成员，并且识别出ELAVL1是YBX1潜在的互作成员。后续作者通过CoIP实验验证了两者的互作。有趣的是，如果将NSUN2或者YBX1基因表达下调后ELAVL1的结合能力也明显下降。这种下调可以通过组成性WT得到恢复。作者随后分析了他们的PAR-CLIP-Seq数据，并观察到它们之间有78%（6,628个中的5,199个）的重合，它们的结合区之间的空间距离更近。这些数据表明，YBX1结合到m5C修饰的mRNA， 并且通过直接招募ELAVL1来调节它的稳定性。
接着，作者通过对肿瘤组织和非肿瘤组织的western验证发现，NSUN2 和YBX1的表达量在肿瘤组织明显升高。通过对199个UCB和50个膀胱组织样本的免疫组化实验发现大部分UCB样本，YBX1和NSUN2都有明显信号，而正常的膀胱组织则没有明显免疫原位信号。通过对这些样品的DFS生存率计算发现，凡是YBX1或者NSUN2表达量高的，预后生存率都比表达量低。
作者进一步小鼠实验发现，相较于control， shYBX1和shNSUN2注射小鼠后其膀胱肿瘤发生情况明显减轻。加了组成型表达的WT后部分恢复小鼠的膀胱癌肿瘤组织大小。对结合位点进行突变后则无法恢复，表明NSUN2的C321A和YBX1的W65A位点对于其行使功能发挥重要作用。通过对注射这些不同细胞系的转基因小鼠0周、 3周、 6周免疫组化和in vivo tumorigenicity实验表明，荧光信号在各敲除小鼠明显减少，但是WT互补后荧光信号恢复。
在T24细胞的RNA-seq和RNA-BisSeq里，作者发现604个 mRNA的m5C甲基化程度和mRNA表达量都显著降低。其中近400个结合在YBX1上。有趣的是，HDGF的3’UTR位点存在m5C修饰，同时与YBX1和ELAVL1结合。HDGF的表达量与NSUN2和YBX1表达量呈正相关。通过T24细胞系和TCC-SUP细胞系平板克隆形成试验（colony-formation assay）发现，体外加入shHDGF明显减少colony，加入HDGF-WT恢复，转基因小鼠下调HDGF表达量其膀胱癌肿瘤组织也明显减少。免疫组化结果表明HDGF在肿瘤组织高度表达。最后作者提出m5C修饰对膀胱癌UCB的促进调控作用机理。NSUN2细胞质表达量增加促进对HDGF的m5C修饰，进而收到YBX1结合招募ELAVL1，稳定HDGF mRNA， 进而促进肿瘤组织的生长和转移。而如果NSUN2表达量下调，HDGF无m5C修饰，就会因不稳定受到降解，对肿瘤细胞和组织的生长和转移产生抑制作用。
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