国自然热点：复旦药院团队揭示香草酸介导的铁死亡恢复结肠炎肠上皮稳态机制

2024年3月2日，复旦大学药学院沈晓燕团队在Pharmacological Research（IF=9.3）上发表了题为“Vanillic acid restores homeostasis of intestinal epithelium in colitis through inhibiting CA9/STIM1-mediated ferroptosis”的文章，利用DSS诱导的结肠炎模型探讨VA对UC的治疗效果并揭示其潜在机制，鉴定了VA的直接作用靶点CA9，发现VA可以通过CA9/STIM1介导的铁死亡抑制恢复肠上皮稳态，从而缓解结肠炎，为UC提供了一种有前景的治疗候选者。

结果1：香草酸减轻DSS诱导结肠炎小鼠的组织损伤和炎症反应

研究者构建了小鼠结肠炎模型，并从造模前一天开始，连续7天给予不同剂量的香草酸（VA），使用治疗溃疡性结肠炎的药物 5-ASA美沙啦嗪作为阳性对照。从体重变化指数、结肠长度、DAI评分以及组织学分析，来探究VA对结肠炎症的影响。

结肠缩短现象是结肠炎中一个明显的变化。DSS给药出现了明显的结肠缩短现象，VA给药组结肠缩短现象受到抑制（图1A、B）。同样，结果发现，VA给药组也明显减轻了结肠炎小鼠体重减少的现象（图1C）。评估结肠炎小鼠疾病活动指数（DAI）评分，DSS给药组小鼠DAI评分高于对照组，而VA给药组结肠炎小鼠的DAI评分相较于对照组下降（图1D）。组织学分析显示，VA有效地改善了结肠粘膜损伤和炎症浸润，小鼠结肠的组织学损伤降低（图1E）。

接着研究者通过定量实验对促炎细胞因子il - 1β、il - 6、il - 17a、tnf - α、和il - 23在结肠组织中的表达进行了评估。结果发现，在DSS诱导的结肠炎小鼠中，这些促炎细胞因子的mRNA水平显著升高，而在不同浓度的VA处理后，促炎细胞因子在结肠组织中的表达呈剂量依赖性的下降（图1F）。研究者使用Tunel染色检测细胞凋亡，结果发现，DSS诱导的凋亡细胞增加，而在VA处理后，细胞凋亡明显减轻（图1G）。肠上皮通透性试验发现，DSS处理的小鼠肠通透性明显升高，而在VA治疗后，肠通透性显著降低（图1H）。这些研究结果表明，VA可有效减轻DSS诱导的肠上皮细胞损伤和炎症反应，促进肠上皮屏障的恢复。

图1 香草酸减轻DSS诱导的结肠炎小鼠的IEC损伤和炎症反应

结果2：香草酸对铁死亡有抑制作用

肠上皮细胞（IECs）死亡是上皮屏障功能受损以及并发肠道炎症的标志。研究表明，铁死亡与肠道疾病有关，阻断铁死亡可显著缓解UC症状，促进肠道修复。因此，VA对铁死亡的调控引起了研究者的关注。通过评估铁死亡标志物GSH、GPX4、MDA、ACSL4、COX2的水平，来探究VA对铁死亡的影响。首先，研究者测定了VA对肠上皮细胞NCM460和HCT116的细胞毒性。结果如补充图SA和B所示，在指定的浓度和时间范围内，VA对肠上皮细胞没有细胞毒性。

研究者使用铁死亡诱导剂Erastin在体外来诱导肠上皮细胞的铁死亡。结果发现，铁死亡诱导剂Erastin促使肠上皮细胞的细胞活力下降，在VA处理后，肠上皮细胞细胞活力得以恢复（图2A）。谷胱甘肽(GSH) /谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)轴是铁死亡最主要的调控方式，通过有效消除过量的ROS，在铁死亡中起关键作用。结果发现，铁死亡诱导剂Erastin处理导致肠上皮细胞中GSH、GXP4的水平下调，在VA处理后有效增加了GSH、GXP4的水平（图2B、C）。并且，在DSS诱导的结肠炎小鼠中观察到的GSH含量显著下降，在VA处理其含量得到恢复（图2C）。

此外，对脂质过氧化物终端产物丙二醛（MDA）进行测量，在DSS诱导的结肠炎小鼠中，MDA含量显著升高，VA治疗减轻了结肠炎小鼠中结肠脂质过氧化水平升高（图S2C）。同时通过C11-BODIPY染色检测细胞内脂质过氧化水平，与对照组相比，经VA处理的细胞，细胞内脂质过氧化水平明显较低（图2D）。PGSK探针标记的代表性免疫荧光图像以及流式细胞术检测结果发现，Erastin处理降低了荧光强度，促进了Fe2+的产生，而VA处理阻断了Erastin 诱导的Fe2+的产生（图2E、F）。对铁死亡诱导剂erastin或VA处理的NCM460细胞进行JC-1染色测定线粒体膜电位，然后进行流式细胞术分析，结果发现，在VA存在的情况下，可以观察到Erastin诱导的线粒体膜电位损失的衰减（图2G）。

接着，研究者通过WB实验从体内和体外评估铁死亡相关标志物和内质网应激相关蛋白的蛋白水平。结果发现，VA在体内和体外均有效抑制了铁死亡相关标志物和内质网应激相关蛋白的上调表达（图2H、I）。免疫荧光染色进一步证实，VA处理小鼠中前铁死亡蛋白COX2 (Ptgs2编码的蛋白)和ACSL4的表达降低（图2J）。

总的来说，以上实验结果证实了VA可以恢复erastin（一种铁死亡诱导剂）引起的细胞活力降低，逆转erastin导致的GSH水平和GPX4水平的下调，用VA处理的细胞表现出显著较低的细胞内脂质过氧化水平，阻断Erastin 诱导的Fe2+的产生，减弱erastin诱导的线粒体膜电位损失，抑制了铁死亡相关标志物ACSL4和内质网应激相关蛋白的上调表达。表明 VA 对铁死亡和铁死亡诱导的ER应激具有显著的缓解作用。

图2 香草酸对铁死亡有抑制作用

S2

结果3：CA9被确定为香草酸的新靶点

紧接着，研究者试图研究VA调节铁死亡的机制，确定其直接治疗靶点。基于结构的虚拟筛选预测了VA的潜在直接分子靶标，排名前十的候选靶点（图3B）。然后利用AutoDock和Pymol将这些候选蛋白与VA进行分子对接，并列出了具体的结合模型和详细的结合能(图3C、D)。结果发现碳酸酐酶IX（CAIX，CA9）和碳酸酐酶VI（CAVI，CA6）这两结合力排名前二的蛋白质是VA最有可能的直接靶点。GEO数据库GSE112366和GSE73661的临床数据显示，在结肠炎患者的结肠样本中，CA9显著上调，而CA6没有上调（图3E）。对GSE112366临床数据进行GSEA分析显示，在CA9表达水平高的受试者中与铁离子反应相关的信号通路显著富集（图3F）。这些发现提示CA9可能在结肠炎的发病机制和进展中发挥重要作用，VA可能依赖CA9发挥其抗结肠炎铁死亡作用。细胞热移实验(CETSA)表明，VA增加了CA9在完整细胞和细胞裂解物中的热稳定性（图3G）。药物亲和力反应靶稳定性(DARTS)显示，在VA存在下，蛋白酶E对CA9蛋白的蛋白水解减弱（图3H）。表明，CA9是VA的直接靶点。

图3 CA9被确定为香草酸的新靶标

结果4：香草酸通过促进CA9和STIM1之间的相互作用减轻铁死亡

接下来研究者研究了CA9在VA介导的抑制铁死亡中的作用以及相关的信号通路。研究者发现VA对CA9的蛋白水平没有影响，推测VA对铁死亡的影响可能是通过其他涉及CA9的蛋白-蛋白互作的方式来介导的，而不是通过CA9的表达来介导的。灵活对接模型的虚拟筛选表明，基质相互作用分子1 (STIM1)和CA9可以形成稳定的蛋白质模型（图4A）。免疫沉淀实验和免疫荧光实验进一步验证发现STIM1可以和CA9稳定结合，并且，STIM1和CA9之间的相互作用和共定位被铁死亡诱导剂Erastin抑制，又在VA的处理之后被恢复（图4B、C）。为了明确STIM1和CA9在抑制铁死亡中的作用。研究者在Erastin刺激下分别过表达STIM1和CA9来模拟VA的作用，结果发现，在VA处理的细胞和CA9/STIM1过表达的细胞中，GPX4和内质网应激标记物的水平相当（图4D、E）。CA9和STIM1的过表达模仿了VA介导的对铁死亡和铁死亡诱导的内质网应激的抵抗。

此外，研究发现，CA9或STIM1的干扰显著阻碍了VA的有益作用，导致显著的脂质过氧化、GPX4的减少、内质网应激的诱导以及和高活性Fe2+的生成（图4F-J）。总的来说，这些发现表明VA通过恢复CA9和STIM1的关联来减轻铁死亡。

图4 香草酸通过促进CA9和STIM1之间的相互作用减轻铁死亡

结果5：香草酸通过调节SREBP-SCD1轴介导的脂肪生成来减轻铁死亡

接下来，研究者研究了与CA9相关的信号通路。GSEA和GO分析显示，来自数据库GSE112366的CA9高表达受试者中脂肪酸相关的脂质信号通路显著富集（图5A、B）。另外，结肠组织中脂肪酸和胆固醇代谢相关基因表达的热图中，研究者发现VA可以显著恢复脂肪酸和胆固醇代谢相关的基因，如Scd1、Acly、Fasn、Hgms1、和Hgmsr在结肠炎小鼠结肠中的作用。然而，对Ldlr、Cd36和Fatp5等脂肪酸摄取相关基因没有明显影响（图5C），这表明VA可能通过调节脂质代谢发挥治疗作用。

SREBP1是调节脂质代谢不可或缺的转录因子，控制SCD1的转录，将饱和脂肪酸 (SFA) 转化为单不饱和脂肪酸 (MUFA)。先前的研究已经证明了单不饱和脂肪酸MUFA在抵抗铁死亡方面的关键作用。接着，研究者探究了VA与SREBP1之间的关系。免疫荧光染色结果来看，研究者发现VA增强了SREBP1的核定位，诱导了SREBP1成熟（图5E）。WB结果进一步发现，VA诱导的SREBP1成熟，进而导致了SCD1蛋白的上调（图5F）。定量分析显示，SREBP1的mRNA水平不受VA影响（图5G），表明VA可能通过转录后方式调节SREBP1的成熟，从而促进SCD1转录。

Fatostatin是SREBP1的激活抑制剂，从补充图B、C结果看出，在铁死亡诱导剂erastin处理的细胞中，脂肪抑制素处理有效消除VA诱导的细胞活力恢复和脂质过氧化减少。此外，使用 SCD1抑制剂CAY10566 处理 NCM460 细胞，发现VA的抗铁死亡活性被SCD1抑制剂CAY10566阻断从（图5H、I）。WB结果发现，VA处理降低了铁死亡相关蛋白和 ER 应激相关蛋白的表达，而 SCD1抑制剂CAY10566 处理之后，增加了这些蛋白的表达，逆转了VA的作用（图5J）。这些发现表明SREBP1-SCD1信号通路在介导VA的抗铁死亡中的关键作用。

图5 香草酸通过调节SREBP-SCD1轴介导的脂肪生成来减轻铁死亡

结果6：香草酸通过 CA9-STIM1 复合物介导的 SREBP1-SCAP 复合物与 INSIG2 的分离促进 SREBP1 活化，从而抑制铁死亡

随后研究者进一步阐明CA9-STIM1复合物在SREBP1-SCD1信号通路中的作用。从图A中发现，SREBP1的核定位在CA9或STIM1沉默后被阻断，证实CA9/STIM1复合物参与SREBP1的成熟。在静止状态下，SREBP1-SCAP 复合物通过与 INSIG 相互作用牢固地锚定在 ER 膜上，从而防止SREBP1-SCAP易位至高尔基体裂解成核定位的成熟形式，利用GRAMM预测了INSIG2和STIM1的三维对接模型，发现STIM1和INSIG2形成了稳定结合（图6C）。从IP实验结果看出，STIM1可以通过与INSIG2结合从而与SCAP/SREBP1复合物结合，VA在增强了INSIG2和STIM1之间的相互作用，同时削弱了STIM1和SCAP/SREBP1之间的结合（图6D）。表明VA通过STIM1将INSIG2束缚到ER并削弱了INSIG2与ER的结合。

与IP结果一致，免疫荧光实验证实VA增强了STIM1和INSIG2的共定位，同时减弱了STIM1和SCAP/SREBP1的共定位（图6E、F），表明VA通过STIM1将INSIG2绑在ER上，减弱了INSIG2与SCAP/SREBP1复合物的结合，从而促进SREBP1的高尔基转运。此外，CA9的沉默消除了VA诱导的STIM1INSIG2复合物形成的增强(图6G)，同时促进了INSIG2/SCAP/SREBP1复合物的组装。

上述结果表明VA促进CA9和STIM1之间的相互作用，从而促进STIM1和INSIG2之间的结合，导致SREBP1-SCAP复合物从INSIG2解离。该过程促进 SREBP1 易位至高尔基体，裂解成其活性形式，并最终促进 SCD1 的转录活性。

图6 香草酸通过CA9-STIM1复合物介导的SREBP1-SCAP复合物与INSIG2的解离促进 SREBP1激活，从而抑制铁死亡