大家好，本周为大家介绍一篇发表在Anal. Chem.上的文章，Top-Down Hydrogen-Deuterium Exchange Analysis
of Protein Structures Using Ultraviolet Photodissociation1，文章作者是加拿大维多利亚大学的Christoph H. Borchers。氢-氘交换质谱（HDX-MS）是一种通过检测蛋白质骨架酰胺氢与D2O溶液中氘的交换来分析蛋白质结构的技术。经典的bottom-up
HDX流程是将氘代后的蛋白在0°C、pH
2.5的条件下进行酶切，随后将肽段样品进入LC-MS进行分析以获得肽段水平HDX信息。此外，还可以采用top-down
HDX法，即将完整蛋白质注入质谱仪，在气相中碎裂并确定碎片的氘化水平。通过比较连续碎片的氘化水平，通常可以确定单个氨基酸残基的交换或保护程度（即氨基酸水平分辨率）。然而，碰撞诱导解离(CID) 引起大量H/D
scrambling（图1）2，导致氘代位点定位失真，因此通常不适用于top-down
HDX-MS 测量。电子捕获解离/电子转移解离（ECD/ETD）可以有效避免scrambling现象，但其对蛋白质序列内部覆盖较低，从而在这些区域的HDX分辨率较低。紫外光解离（UVPD）利用高能紫外光激发分子或离子，使其内部的化学键断裂，从而生成丰富的碎片离子，同时避免scrambling。本文即在配备有213nm
UVPD的Orbitrap
Fusion Lumos Tribrid 质谱仪（图2）进行了top-down
HDX分析，同时优化了top-down
HDX数据分析软件，证明了该方案可以有效提高top-down
HDX的分辨率。图1.（A）理论上不发生scrambling时的离子碎裂情况。（B）发生scrambling时离子碎裂情况。图2.配备UVPD的Orbitrap
Fusion Lumos Tribrid 质谱仪原理图。Top-down
HDX分析是通过连续在线混合蛋白质与D2O，然后与酸性淬灭（quench）溶液混合并直接注入质谱仪来进行的，本实验中氘代和淬灭时间由混合毛细管的长度和注射溶液的注射器的流速决定。作者选取肌红蛋白（myoglobin）作为标准蛋白，首先对完整蛋白的氘代水平进行了评估。如图3，氘标记后质谱检测到质荷比位移169
Da，而肌红蛋白中最大可氘代残基数目为277个，由此算出有108个酰胺氢处于结构中的保护状态。这与肌红蛋白晶体结构中112个骨架酰胺氢参与形成氢键的结果相吻合。
在筛选出单一电荷态的肌红蛋白母离子后，作者使用213nm激光对肌红蛋白进行UVPD碎裂（脉冲次数2-62），该过程是在Orbitrap
Fusion Lumos Tribrid 质谱仪的双压线性离子阱的低压池中进行的，产生的碎片在Orbitrap质量分析器中检测。此外，作者也使用了ETD碎裂（反应时间1-25ms）作为对照和互补。图4A为包含有效氘代数据的碎片离子覆盖图。ETD和UVPD之间共有的碎片离子显示出相同的氘代值，证实UVPD中没有发生scrambling。
图4.（A）用于HDX分析的碎片离子覆盖图。（B）上：碎片离子的累积氘代值。下：残基特异氘代值。Top-down
HDX数据分析通过 HDX
Match软件进行。未氘代的碎片离子峰是重要的零点，用于计算氘代位移量，然而未氘代碎片中a、x、y离子的同位素拟合较差。因此作者优化了碎片离子峰型拟合算法，称之为“+
0/1/2”（即标准碎片离子和由其衍生的增加1或2
Da 的离子的混合物）和“-
0/1/2”（即标准碎片离子和由其衍生的损失1或2
Da的离子的混合物），其能够拟合出该碎片离子理论的谱图，由此作为零点计算氘代位移值。通过该优化后的算法计算得到了碎片的氘代值，并由此计算出了残基水平氘代值（图4B）。将氘代值映射到肌红蛋白的晶体结构上（图5），发现top-down
HDX得到的氘代情况与晶体结构有一定的吻合度。
图5.残基氘代值映射在肌红蛋白（PDB：1YMB）晶体结构上。本文率先在Orbitrap
Fusion Lumos Tribrid质谱仪上使用213nm
UVPD对肌红蛋白进行了HDX检测，并优化了后续数据分析软件，成功实现了在该平台上的top-down
HDX分析。该方法与ETD 碎裂法结果互补，提高了方法的HDX分辨率。同时本文使用到的软件可供在线免费使用。本文是在Orbitrap
Fusion Lumos Tribrid进行top-down
HDX的典型案例。
原文：Top-Down
Hydrogen–Deuterium Exchange Analysis of Protein Structures Using Ultraviolet
Photodissociationwww.x-mol.com/groups/li_huilin
参考文献![]()
1. Brodie, N.; Huguet, R.;
Zhang, T.; Viner, R.; Zabrouskov, V.; Pan, J.;
Petrotchenko, E.; Borchers, C., Top-Down Hydrogen-Deuterium Exchange
Analysis of Protein Structures Using Ultraviolet Photodissociation. Anal. Chem. 2018, 90, 3079-3082.2. Wollenberg, D. T. W.;
Pengelley, S.; Mouritsen, J.
C.; Suckau, D.; Jorgensen, C. I.; Jorgensen, T. J. D.,
Avoiding H/D Scrambling with Minimal Ion Transmission Loss for HDX-MS/MS-ETD
Analysis on a High-Resolution Q-TOF Mass Spectrometer. Anal. Chem. 2020, 92 (11), 7453-7461.
