大家好，本周为大家介绍一篇发表在Nat. Struct. Mol. Biol.上的文章，Resolving chaperone-assisted
protein folding on the ribosome at the peptide level1，文章作者是美国东北大学的John R. Engen。
体内的蛋白质折叠与翻译是同时发生的，其逐步从N端到C端形成结构。这与从变性剂中的折叠不同，因为新生链的全部元件在翻译时并非同时可供折叠，导致折叠往往是依次进行的。核糖体出口通道的狭窄和带电特性限制了新生多肽链的构象空间，并可能在热力学上导致某些结构域不稳定，从而延缓其完全折叠。触发因子（TF）广泛结合大肠杆菌的多数新生蛋白，并具有多种功能，包括抑制聚集、促进折叠等，但TF如何精确调控蛋白质翻译后的折叠过程仍不完全清楚。鉴于新生蛋白质的固有结构异质性，尤其是在核糖体和相关分子伴侣的环境中，探测局部新生链（NC）构象存在技术挑战。本研究主要采用氢氘交换质谱（HDX-MS）技术来分析新生蛋白的局部构象和动态行为。以二氢叶酸还原酶（DHFR）为模型，研究发现核糖体和伴侣蛋白TF协作，为新生链的部分结构单元提供了一种新的独立折叠路径。作者选择用大肠杆菌DHFR（图1a、1c）作为模型蛋白，研究其在核糖体上的共翻译折叠过程。通过在DHFR的不同片段的C末端添加核糖体停滞序列，能够控制翻译的停止，从而捕捉到蛋白质合成过程中的特定折叠中间体。由此，作者制备了停滞的核糖体-新生链复合物（RNCs），这些复合物代表了体内折叠过程中的不同阶段（图1b）。此外，作者还构建了一个全长DHFR作为对照。作者将纯化的RNCs置于氘代缓冲液中不同时间（10 s、100 s、1000 s），酶切后产生的肽段通过液相色谱（LC）和离子淌度（IMS）进行分离，最后进行检测（图2a）。作者首先分析了FL+58RNC和FL
DHFR（即链接在核糖体上的DHFR和游离的DHFR）的氘代情况，发现二者氘代几乎相同（图2b），表明即使DHFR完全翻译并与核糖体耦合，它也是以天然状态折叠的。这一实验也表明作者建立的对该体系的分析方法是可行的。图2. HDX-MS实验流程以及FL+58RNC和FL
DHFR的氘代曲线。接下来作者研究了DHFP的共翻译折叠路径，通过比较不同新生链（NC）长度下的HDX水平来探寻DHFR的折叠动力学。研究发现，DHFR的N端区域（包括DLD中的β1链的一部分）在翻译时相对于全长翻译出来时的水平更低（图3a）。随着NC的延长，N端区域进一步氘代，表明DLD的折叠是滞后的，直到全长被翻译出来（图3b）。如图3c，在1-106RNC中，腺苷结合域（ABD）的氘代水平开始近似天然蛋白中的HDX，表明这些部分开始折叠。当合成了DHFR的前126个残基（1-126RNC）时，ABD的折叠完成。最后一步核糖体完成了DLD的最终折叠（包括N-末端片段）。由此作者得出了构建DHFR时的完整共翻译折叠路径。随后作者研究了核糖体是如何稳定共翻译时的折叠中间体。作者发现ABD的β-sheets在翻译过程中是逐步产生HDX保护的。而独立表达的ABD片段跟其在全长中表达相比是较为无序，且只有最长的片段（1-126stop）是可溶的（并且需要在GPF标签的辅助下）（图3d），这表明ABD区域在孤立状态下无法折叠为稳定结构。同时，在1-126stop中，残基93-118表现出显著的去保护，表明该序列在溶液中是无序的，而在对应的RNC中，该序列被限制在核糖体出口隧道内（图1b和图3c）。此外，通过对FL + 58RNC进行分析，发现该DHFR结构几乎与孤立结构域相同，表明核糖体出口隧道对DHFR的结构有保护作用（图2b）。作者随后关注了DHFR在核糖体附近的折叠和活性表现。HDX分析表明FL + 58RNC与FL
DHFR结构几乎相同，即使将DHFR更靠近核糖体表面（通过含38个残基的linker，即FL + 38RNC）也没有显著影响DHFR的整体折叠（图4a）。此外，如图4b，FL + 58RNC和FL + 38RNC都显示出酶活性，但FL + 58RNC和FL + 38RNC的酶活性比FL
DHFR高2到4倍，表明核糖体可能通过相互作用改变了DHFR的活性位点。更短linker的FL + 28RNC没有氧化还原酶活性，因为linker长度不足以让DHFR的C端暴露在核糖体出口隧道外，导致DLD无法折叠。而加入C端多肽可以一定程度恢复FL + 28RNC的活性，说明DHFR在核糖体上已具备折叠能力，等待C端完全暴露。这些结论表明，DHFR可以在核糖体附近折叠，并且核糖体有助于提高其酶活性。图4. 与核糖体接触调节新生DHRF的结构且不诱导去折叠。接着作者讨论了触发因子（TF，图5a）与DHFR新生链在核糖体上的相互作用。与游离的TF相比，TF的三个结构域（核糖体结合域（RBD）、底物结合域（SBD）和肽基脯氨酰顺反异构酶域（PPD））在与DHFR新生链结合时表现出显著的氘交换保护（图5b）。SBD的两个“臂”区域特别重要，随着新生链长度增加，第二臂的亲水区域受到更强的保护（图5c）。TF通过与DHFR新生链的多重相互作用，辅助其在核糖体上折叠。随后作者主要探讨了触发因子（TF）如何影响核糖体上的DHFR新生链的折叠过程。通过分析缺乏TF（ΔTF）的DHFR新生链（1–106RNCΔTF和1–126RNCΔTF），发现尽管在没有TF的情况下，HDX交换行为存在轻微差异，但折叠仍然发生，表明DHFR的ABD区域折叠不依赖于TF的存在（图3c）。此外作者通过定量蛋白组学分析得出，1–106RNC主要通过疏水作用与TF结合，而1–126RNC在高盐条件下依赖电荷作用与TF结合，说明TF对新生链的结合依赖于电荷和疏水性。而引入不稳定突变的1–126RNC在高盐条件下与TF结合更强，这表明TF通过识别未完全折叠中间体的疏水表面进行结合。最后作者研究了NC如何与核糖体蛋白相互作用。通过对比含有新生链的核糖体（RNC）与空核糖体（70S）的HDX数据，作者发现这些蛋白在新生链存在时，在特定位置受到了保护，并且这种保护效应通常与NC的长度有关（图6b-g）。位于出口通道中的L22的环状结构在所有NC长度下均受保护，反映了SecM序列与L22的相互作用（图6a）。L23上的肽段8–29在1–106RNC和1–126RNC中得到了强保护，与TF的结合有关（图6d、6e）。有趣的是，即使在没有招募TF的1–64RNC中，这一位置也受到了保护，可能是由于新生链与酸性TF结合位点的静电相互作用（图6c）。L23形成的发夹环（肽段61–84）在1–106RNC和1–126RNC中未受保护，但在其他RNC中得到了保护，这表明TF与L23可能通过NC进行异位通信（图6b）。这些数据表明，新生DHFR并不是随机与核糖体出口通道蛋白相互作用，而是可能根据肽链的化学性质，选择特定的相互作用路径，从而影响其共翻译折叠的途径。在文章的讨论部分，作者总结了核糖体协同翻译折叠过程中的一些重要机制和结论。首先DHFR的协同翻译折叠并非严格按照N端到C端的顺序，也不是同时发生的，而是结合了这两种机制（图7）。核糖体通过充当溶解标签和遮蔽C端的方式，帮助新生链避免在折叠过程中发生聚集或热力学失稳。TF优先结合部分折叠或接近完全折叠的新生链（如1–106RNC、1–126RNC、FL + 28RNC），而对于未折叠或结构松散的链则不容易结合。TF通过与疏水和亲水表面的结合，维持了新生链的折叠稳定性。核糖体表面与新生链的相互作用可以调节折叠中间体的稳定性，并可能在多域蛋白的N端功能调节中发挥作用，例如促进辅因子的装载。本文选取DHFR作为模型蛋白，巧妙地设计了实验，揭示了核糖体上蛋白质合成过程中的蛋白质折叠，以及分子伴侣如何调节这一过程。同时也反映出HDX-MS数据集不仅适用于分析新生链和核糖体蛋白质的相互作用，还能够用于揭示翻译过程中难以通过传统结构生物学方法研究的动态过程。撰稿：罗宇翔
编辑：李惠琳
原文：Resolving
chaperone-assisted protein folding on the ribosome at the peptide levelwww.x-mol.com/groups/li_huilin
参考文献![]()
1. Wales, T. E.; Pajak, A.;
Roeselová, A.; Shivakumaraswamy,
S.; Howell, S.; Kjaer, S.;
Hartl, F. U.; Engen, J. R.;
Balchin, D., Resolving chaperone-assisted protein folding on
the ribosome at the peptide level.Nat. Struct. Mol. Biol. 2024.
