大家好，今天给大家分享一篇发表在Journal of the American Society for Mass Spectrometry 上的文章，题目是Characterization of a Monoclonal Antibody by Native and Denaturing Top-Down Mass Spectrometry1，文章的通讯作者是美国俄克拉荷马州立大学的Luca Fornelli助理教授。
Native MS是揭示完整单克隆抗体异质性的重要方法，能够在非变性条件下对完整的抗体前体离子进行检测，但是在以往的研究中很少利用Native的串联质谱对复杂的生物分子进行测序。然而，Top-down mass spectrometry (TDMS)可以在变性（dTDMS）或非变性（nTDMS）条件下进行电喷雾电离。在dTDMS中，一般使用有机溶剂和非中性的pH条件（通常为酸性）使蛋白质样品展开。虽然dTDMS为我们提供了对氨基酸序列和PTM定位的深入了解，但通常会丢失蛋白质的高阶结构信息。相反，nTDMS是使用质谱相容盐（通常是乙酸铵）组成的电离溶液在接近中性的pH值下进行电喷雾电离的，潜在地保留了蛋白质之间的非共价相互作用，从而保留了蛋白质的高阶结构。而这篇文章的主要内容就是系统地考察了四种不同的离子解离方法(即HCD、ETD、EThCD和UVPD)，在表征变性和非变性单克隆抗体曲妥珠单抗前体离子方面的能力。
表1 手动鉴定dTDMS和nTDMS串联质谱图后的序列覆盖率
在变性和非变性电喷雾电离条件下获得的前体离子所带电荷有所不同。对于dTDMS，选择信号最强的49价电荷态（m/z=3026）离子；对于nTDMS，选择27价电荷态（m/z=5490）离子。从实验结果来看，在变性和非变性条件下，用相同的碎裂方法得到的谱图总体上是相似的。对于HCD和ETD的碎裂方式而言，在nTDMS条件下的碎裂情况比dTDMS条件的要好，而EThcD的碎裂情况基本相同。另一方面，UVPD得益于高电荷前体离子的分离，在序列覆盖率上更有优势，这种影响在Hc上是明显的，其中UVPD在dTMDS中的序列覆盖率比在nTDMS中高6%，达到25% (重链所有离子解离方法的最高值)，这要归功于肽链中心主链断裂产生的一系列大产物离子。相反，轻链序列覆盖率在nTDMS中更高。
HCD的结果与ETD的结果基本相似。从dTDMS到nTDMS，序列盖度显著增加（Lc序列盖度从17.4%增加到32.9%；Hc：从14.5%到20.5%）。在非变性条件下，HCD在总体序列覆盖率方面优于ETD，但在dTDMS中，HCD的覆盖率最低（15.5%）。这也证实了先前的研究报道，即通过HCD产生的序列覆盖率与完整蛋白前体离子的电荷密度呈负相关。
图2 每种离子活化方法的独特产物离子的维恩图。红色表示非变性的独特产物离子，蓝色表示变性的独特产物离子，橙色表示相同的产物离子。产物离子被认为是中性质量，因此，在维恩图中没有考虑到分配片段的电荷状态的差异。ETD和UVPD结果是多个实验(三个ETD和UVPD持续时间)的组合。
总的来说，相同离子解离方法下获得的序列覆盖率在dTDMS和nTDMS之间没有显著变化（HCD除外）。但这一结果并不能完全概括实际解离模式中可能存在的差异。如图2所示，维恩图比较了在变性和非变性实验条件下分配的独特产物离子，至少39%的匹配片段在dTDMS和nTDMS之间是相同的。可能的原因是完整抗体中碎片的产生主要是由二硫键所在的位置驱动的。
图3 曲妥珠单抗Lc和Hc的组合碎片图，包括dTDMS和nTDMS实验中所有匹配的产物离子。CDR区用颜色编码(CDR 1、2和3分别为黄色、绿色和橙色)。
Hc获得的相对较高的序列覆盖率主要归功于nTDMS，该实验条件允许在Hc的两个部分内分配主链切割，而dTDMS下则无法很好地表征。CDR区是抗体重链和轻链可变域内的一部分，而CDR3区位于抗体上第一个和第二个二硫键保护区域之间，许多研究报道过通过变性或是非变性的Top-down质谱实验对抗体CDR3区进行测序。然而，由于受到二硫键的保护，CDR1区和CDR2区通常是更难表征的，它们不仅位于二硫键内，而且Hc的CDR2区也特别长。如表2所示，在dTDMS中，唯一能部分表征所有这些区域的离子解离技术是EThcD，但从总体上看，dTMDS中Hc在CDR1和CDR2区域内的测序都比较差。在nTDMS实验中，CDR的表征得到了改善。总的来说，Lc和Hc的CDR2区是最难表征的，在任何电离条件下覆盖率都≤50%。在本次实验中，EThcD是对Lc和Hc的CDR2测序最成功的离子解离方法，不仅优于ETD和UVPD，而且对比之前通过ECD获得的结果也有改进。这强调了EThcD在二硫键保护区域测序的优势性。
虽然nTDMS通常被认为不是多肽测序的最佳选择，但在曲妥珠单抗完整抗体的测序与表征上，nTDMS被证明优于dTDMS，可用于完整曲妥珠单抗的表征。由于作者的实验中，dTDMS和nTDMS实验的AGC target（即累积电荷数）是相同的，因此nTDMS选择了更多的前体离子（因为前体离子电荷态较低），为nTDMS提供了更高的信噪比优势。然而，作者认为通过nTDMS获得的结果略有改善主要是有两个因素：首先，完整抗体的碎片化受到二硫键的极大限制，即使在变性条件时，二硫键也会阻止前体离子的完全展开。其次，与nTDMS相比，在dTDMS中，前体离子的电荷态分布更广，可能导致与其他碎片离子的信号重叠。而nTDMS谱图受离子信号重叠的影响较小，可以识别低丰度的产物离子。
总而言之，单克隆抗体代表了一类结构特殊的蛋白质，Native MS不仅可以用于完整抗体的测定，而且在测序方面也有独特的优势。
撰稿：梁梓欣
编辑：李惠琳
文章引用：Characterization of a Monoclonal Antibody by Native and Denaturing Top-Down Mass Spectrometry
Oates RN, Lieu LB, Srzentić K, Damoc E, Fornelli L. Characterization of a Monoclonal Antibody by Native and Denaturing Top-Down Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 2024 Sep 4;35(9):2197-2208.
