大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical and Bioanalytical Chemistry上的文章，Towards a universal method for middle-down analysis of antibodies via proton transfer charge reduction-Orbitrap mass spectrometry [1]，文章的通讯作者为美国俄克拉荷马州立大学的Luca Fornelli助理教授。
图1.基于 PTCR 实现抗体自中而下分析的通用方法的数据采集工作流程。基于LC 分离（左上）的亚基先后通过一级、二级质谱。之后在 PTCR MS3实验中，MS2中生成的产物离子通过线性离子阱中单个 1800 m/z 宽的隔离窗口进行分离，并在 Orbitrap 检测之前进行 PTCR（右下）。插图显示了 PTCR 之前（顶部）和之后（底部）检测到的产物离子的电荷状态的差异。左下图显示了在用于检测高达 m/z 8000 的电荷减少产物离子的 PTCR MS3 实验中，应该将标准 AGC 替换为基于 Orbitrap TIC 的 AGC 进行质量精度校正。
表1. 各离子激活方法的碎片参数、PTCR反应时间的取值范围和优化过后的最佳值。
利用这种基于 PTCR 的抗体自中而下分析可以改善测序的效果。PTCR 使 NIST mAb 亚基的序列覆盖率在HCD的情况下比 MS2实验的结果增加了3-15%，在ETD和EThcD的情况下增加了10-20%。（图2 E）。PTCR的应用还提高了可以识别的特异性片段的数量（图2 F）和互补离子对的数量（图2 H），这对于增加主链裂解的置信度非常重要。
图2. NIST mAb Fd'亚基的表征。碎片图谱分别通过（A）ETD、（B）HCD和（C）EThcD MS2和随后PTCR MS3生成。（D）是由HCD 和 EThcD MS2 – PTCR MS3 结果组合得出的碎片图。MS2和相应的PTCR MS3 实验分别在（E）序列覆盖度、（F）特异性离子数量、（G）片段质量分布和（H）互补离子数量方面进行比较。MS2 结果为黑色，PTCR MS3 结果呈粉红色。
图3. SILu
Lite K4 (IgG4) Fd'亚基的 6ms EThcD MS2 - 30 ms PTCR MS3 图谱。插图显示了信号重叠极少的低电荷产物离子。
总的来说，这项研究提出的基于 PTCR 的分析工作流程解决了抗体 MD MS 分析亚基片段相关的两个潜在问题，第一是通过优化 PTCR 条件以减少离子信号重叠，获得光谱解释的简便性和可信度；第二是由于修改了 AGC 程序，PTCR MS3 实验在宽 m/z 范围内的质量准确度得到了提高。无需明显的优化，这种数据采集方法也可以应用于其他类别的mAb。同时这种基于 PTCR 的MD MS方法也有望应用于其它更广阔的生物制药研究领域。
撰稿：王子怡
编辑：李惠琳
文章引用：Towards a universal method for middle-down analysis of antibodies via proton transfer charge reduction-Orbitrap mass spectrometry.
Oates, R. N.; Lieu, L. B.; Kline, J. T.; Mullen, C.; Srzentić, K.; Huguet, R.; McAlister, G. C.; Huang, J.; Bergen, D.; Melani, R. D.; et al. Towards a universal method for middle-down analysis of antibodies via proton transfer charge reduction—Orbitrap mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 2024. DOI: 10.1007/s00216-024-05534-z.
