图 1.用于谱图匹配的常规去卷积与同位素拟合方法的比较。（A） 在去卷积方法中，原始谱图在与候选蛋白质形式匹配之前被转换为中性片段质量。（B） 在同位素拟合方法中，将候选蛋白质形式的理论同位素分布直接与没有去卷积的实验谱图进行比较。
作者还研究了内部离子，以确定它们的普遍性并评估它们对更高 FDR 值的潜在贡献。使用 ProSight Native 中的 TDValidator 模块，作者发现 52% 和 19% 的匹配碎片分别是顶部 HCD 和 ETD 谱图匹配中的内部离子。
作者使用热图来可视化同位素拟合与去卷积的序列覆盖率。每行代表 128 种不同碎裂设置中的最佳谱图匹配，每列表示序列中的一个氨基酸（图 3a 和 3b）。作者观察到同位素拟合与去卷积的明显差异，由于序列覆盖率的增加，两条链的几个区域颜色更浓。在这些匹配中，使用质量去卷积的序列覆盖率分别仅为 13 ± 5% 和 13 ± 4%。而使用同位素拟合时重链覆盖率增加了 3 倍，达到 39%（图 3d），轻链序列覆盖率增加了 2.5 倍，其中轻重链可变区的序列覆盖分别从21 ± 9% 和 23 ± 8%提高到 42 ± 21% 和 39 ± 17%。将 THRASH 质量去卷积的可靠性值质量评分从 0.55 降低到允许的最小阈值 0.01 导致每个谱图检测到的片段质量数增加约 30%，但仅略微增加了序列覆盖率约 1%。这表明较低的可靠性值阈值会大大增加假阳性片段质量数的数量，而不会显著增加序列覆盖率。
对于完整的抗体链，检测大片段对于获得整个蛋白质的序列覆盖至关重要。然而，由于多个电荷会降低强度，因此大碎片可能难以去卷积。使用同位素拟合，我们观察到大匹配片段的数量增加。在上述 128 个最佳谱图匹配中，使用质量去卷积的匹配碎片质量为 6,917 ± 5016 Da，而使用同位素拟合的匹配碎片的质量为 8,478 ± 4688 Da。
总的来说，作者提出了一种替代去卷积的谱图匹配方法，该方法放弃了典型的质量去卷积步骤，而是通过理论同位素分布直接将候选蛋白质形式与谱图进行比较。结果表明，同位素拟合可以在不增加 FDR 的情况下显着增加大蛋白（如抗体）的序列覆盖率。此外，通过利用批处理模式下的方法对较大的TDMS的数据集进行高通量分析，同位素拟合可用于多个谱图分析。蛋白质片段数据分析的这些改进和未来改进将有助于更好地确定 TDMS 在定义生物治疗药物的蛋白质形态方面的作用。
[1] Robey, M.T., Durbin, K.R. Improving top-down sequence coverage with targeted fragment matching[J]. Journal of the American Society for Mass Spectrometry，2024.
