大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Cyclic Ion Mobility for Hydrogen/Deuterium Exchange-Mass Spectrometry Applications1，文章的通讯作者为曼彻斯特大学的Argyris Politis博士。
氢氘交换质谱(HDX-MS)是一种成熟的探测溶液中蛋白质高级结构的方法。随着HDX-MS所研究样品的复杂性日益增加，对仪器分辨能力的要求也越来越高。将离子淌度(ion mobility, IM)整合到HDX-MS工作流程中已被证明可以通过提供气相中肽离子的分离效率来提高数据质量。这对于整合膜蛋白(IMPs)等在HDX-MS分析中经常存在较低序列覆盖率或冗余度的靶标至关重要。近期，“升级版”的IM设备被开发出来——具有循环离子淌度( Cyclic IM)的质谱仪。这是一种具有“跑道”形状的IM设备，能够实现可扩展的多通道IM分离。本文中，作者提出了一种整合cIM的新型HDX-MS工作流程，有望给更复杂的系统带来更高的准确性和速度。
作者首先对Cyclic IM进行了性能基准测试。当使用“one-pass”路线时，Cyclic IM的工作方式是无论离子大小和所带电荷如何，所有离子通过设备一次，而“multipass”路线是所有离子反复环绕设备，直到它们在指定的时间窗口过后弹出。作者使用非氘代样品分别进行“one-pass”和“multipass”测试，并将结果与传统的线性IM设备(SYNAPT G2-Si)进行比较。为了最大限度地保持平行性，作者使用了相同批次的纯化蛋白和缓冲液和相同的UPLC设备。结果如图所示，使用one-pass模式下SMO、XylE、MsbA和SecYEG的肽段鉴定相比于使用线性IM设备分别提高了144%、32%、48%和24%(图1a)，这意味着所有靶标的序列覆盖率和冗余率增加。其中 SMO序列覆盖率增加了 22%，从而覆盖了以前在线性IM的HDX-MS工作中遗漏的重要功能区域(图1b)。另一方面，multipass的效率始终不如one-pass。与线性IM相比，multipass对SMO和XylE的肽鉴定分别增加了84和10%，而对MsbA和SecYEG的肽鉴定分别减少了7和52%。这是不合常理的，因为分离效率的提高往往有助于提高仪器的分辨能力。
图1.(a)使用线性IM(橙色)、Cyclic IMS one-pass(粉红色)和Cyclic IMS multipass(蓝色)对SMO、XylE、MsbA和SecYEG进行肽鉴定的数量。(b)使用线性IM(橙色)、Cyclic IMS one-pass(粉红色)和Cyclic IMS multipass(蓝色)的SMO肽覆盖图。虚线框表示未在线性IM上检测到的序列片段。
图2.XylE在(a)One-pass和(b)multipass中探测到的前2000个最强离子的DT和漂移FWHM值。红色虚线表示Apex3D软件自动计算的漂移FWHM趋势线。
图3.手动调整前后Xyl E在(a)One-pass和(b)multipass的不同漂移 FWHM 趋势线的肽鉴定数量。红色虚线表示使用默认自动计算的趋势线获得的肽段鉴定数。
图4.(a)对SMO、XylE、MsbA和SecYEG的肽鉴定数，使用自动计算趋势线的multipass(蓝色)、11−14趋势线的multipass(深蓝色)、自动计算趋势线的one-pass(粉色)以及one-pass/multipass组合输出(绿色)。(b)XylE和SMO的序列覆盖图。常见的肽为绿色，而multipass和one-pass特有的肽分别为蓝色和粉红色。
最后作者将环形离子淌度应用于HDX-MS工作流程中，评估其效率。与单独采用one-pass或multipass相比，one-pass/multipass组合分析可成功监测所有蛋白质中的220种额外肽段。这种新方法不仅提高了肽鉴定率，而且还提供了高质量的肽，这些肽可以在随后的HDX-MS实验中进行监测。观察到的HDX模式与已知的IMP跨膜拓扑结构之间的强相关性支持了这一点(图5b)。
图5.(a)流程图概述了新的HDX-MS工作流程，结合one-pass/multipass肽段鉴定。(b)WTXylE的同源性模型(基于4GBY)的两种格式。一分钟的HDX数据被热映射到结构上，未测序的区域为灰色。
本文中，作者提出了一种整合cIM的新型HDX-MS工作流程，该工作流程有助于未来具有挑战性的目标生成更高质量的HDX-MS数据。与上一代SYNAPT G2-Si仪器进行基准测试，证明了循环IMS在相同实验条件下提高自下而上的LC-MS数据质量的能力，其提高的灵敏度、动态范围和迁移率分辨率能够提高所有评估靶标的序列覆盖率或冗余度。尽管如此，实验中仍有一些蛋白序列片段未被捕获。未来通过优化碰撞能量、淬灭缓冲液组成或结合零下色谱法等可能是目前具有挑战性的靶标获得最佳序列覆盖的途径。
撰稿：陈凤平
编辑：李惠琳
文章引用：Cyclic Ion Mobility for Hydrogen/Deuterium Exchange-Mass Spectrometry Applications
Griffiths, D., et al., Cyclic Ion Mobility for Hydrogen/Deuterium Exchange-Mass Spectrometry Applications. Analytical chemistry (Washington), 2024. 96(15): p. 5869-5877.
